高分辨率納米單顆粒分析儀 Nanocoulter Ⅰ
一種全“芯”的細胞外囊泡檢測手段
胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles, MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細胞激活、損傷或凋亡后從細胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm。外泌體（exosome）是一種由細胞釋放到細胞外基質的膜性小囊泡，直徑約為40-100nm（有說30-150nm，目前尚無定論），廣泛存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發(fā)現(xiàn)細胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標志物。
相比外泌體研究遍地開花的火熱程度（僅國內(nèi)6月份就有217篇相關論文），外泌體純化和提取方法可謂是差強人意。目前主流的方法有超速離心（UC）、密度梯度離心（DGC）、免疫捕獲、聚合物沉淀（Precip）、超濾（UF）、排阻色譜（SEC），以及微流控分析芯片等。往往一種提取方法無法得到足夠純度、濃度的外泌體，每種方法的適用樣品種類也不一樣。
圖1 細胞外囊泡的形成過程
國際細胞外囊泡學會（ISEV）在2014年提議，對于分離獲得的外泌體需要從三個層面進行鑒定：
（1）Western Blot（WB）鑒定外泌體表面標志物；
（2）透射電鏡（TEM）鑒定外泌體形態(tài)；
（3）粒徑分析鑒定外泌體大小。免疫印跡與電鏡觀察耗時長、操作復雜、價格昂貴，在實際研究中難以做到每個外泌體樣本都去做WB與TEM，所以急需一種快速簡便的粒徑分析方法，來作為外泌體鑒定的 “先鋒” 。
Nanocoulter Ⅰ “芯”方式助力外泌體提取純化研究
圖2 Nanocoulter Ⅰ外觀
Nanocoulter Ⅰ 單顆粒檢測，可液體活檢、一個樣本測試僅需5-10分鐘，測試樣本可回收等特性，恰好貼合該需求，目前已經(jīng)廣泛應用于細胞外囊泡（外泌體）的提取鑒定工作中。
圖3 Nanocoulter Ⅰ原理圖
圖4 Nanocoulter Ⅰ核心技術
納米庫爾特原理，測試過程是將待測外泌體分散在電解液中，隨其通過特定孔徑的納米孔芯片，外泌體通過納米孔的一瞬間會占用相同體積電解液的位置，在孔內(nèi)外兩電極間的電阻（恒電流設計的電路）會發(fā)生瞬時變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號的強度和次數(shù)與通過納米孔的外泌體顆粒大小及數(shù)目成一定比例，直接將脈沖信號進行轉換，即可獲得檢測樣品中外泌體的粒徑和粒子數(shù)信息。
Nanocoulter Ⅰ采用新一代電學原理，
?單顆粒檢測，顆粒粒徑、濃度、zeta電位、形態(tài)多維度檢測
?不受樣本吸光度、折射率影響，與樣本光學性質無關
?與顆粒布朗運動無關，不受樣品黏度影響
?顆粒之間無干擾，對多分散樣本有很好的測試效果
?高分辨率，可精確看到樣本團聚、破裂、沉降等細微變化
選型表
Nanocoulter Ⅰ 性能參數(shù)：
隨著研究的深入，更多的分離提取外泌體的方法被開發(fā)出來，也有多種提取方法聯(lián)用的方式，看似百花齊放，實則良莠不齊，甚至都不盡如人意。Nanocoulter Ⅰ 逐個測量外泌體粒徑，得到外泌體的真實粒徑濃度分布，可快速判斷提取方法的優(yōu)劣。
圖5 不同分離提取方法的外泌體粒徑測定
Nanocoulter Ⅰ的原理決定測得的數(shù)據(jù)為真實粒徑信息，無需經(jīng)過反演算或者推導得出，并且配備多種尺寸的已知粒徑和濃度的標準顆粒（60-300nm，20nm一個梯度）來作為基線數(shù)據(jù)，實現(xiàn)測量數(shù)據(jù)的定量校準，確保粒徑、濃度數(shù)據(jù)的準確。無論是不同粒徑的混合樣本，還是有細微差異的同粒徑樣本，均能準確無誤的辨別出來。
圖6 不同廠家生產(chǎn)的標準微球的細微差異
圖7 外泌體樣本檢測信號脈沖圖
圖8 外泌體樣本測試報告
應用領域：
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脂質體、病毒與類病毒顆粒生產(chǎn)品質把控及標準制定（mRNA疫苗 細胞治療、基因治療）；
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細胞外囊泡、外泌體不同提取方法的篩選，外泌體的鑒定；
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藥物載體、蛋白質、疫苗、人造乳糜顆粒的粒徑、濃度測定，生產(chǎn)批間差控制；
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血細胞、血小板、細菌（油田等）、免疫檢測功能顆粒等微粒的計數(shù)；
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聚苯乙烯微球、磁珠顆粒等有機和無機顆粒品質把控；
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化妝品、半導體、工業(yè)涂料、染料與墨水化學、機械拋光、催化劑等工業(yè)生產(chǎn)材料性能研究。
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