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江萊生物-中國老牌試劑供應(yīng)商

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細(xì)胞爬片制備詳細(xì)過程

時(shí)間:2015/7/24閱讀:219
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【爬片的準(zhǔn)備】

1.爬片可用一般的蓋玻片,也可用爬片;

 

2.應(yīng)用蓋玻片,可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小,以備置于6孔板、12孔板或24孔板;裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪,或者是口腔科的那種小沙輪,輕輕劃一下后,稍用力一掰就分開了。

 

如果接種大皿的話,我一般不將蓋玻片切開,直接清潔后放入培養(yǎng)皿中,到染色時(shí)再將之切開,這樣既保證了細(xì)胞均一性,又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。

 

3.將剪裁好的爬片,置于濃硫酸中浸泡并過夜,第二天先用自來水沖洗20遍,再置于無水酒清中浸泡6小時(shí),再用三蒸水沖洗3遍(個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話,細(xì)胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

 

4.高壓后取出放入烤箱中烤干,備用。烤干后可放入超凈臺(tái)中。

 

5.關(guān)于多聚賴氨酸,很多人都將玻片用此處理,以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時(shí)從來沒用過多聚賴氨酸,細(xì)胞貼壁仍然很好,且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

 

 

 

【細(xì)胞爬片】

 

1.*消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于*培養(yǎng)基中。

 

2.加細(xì)胞時(shí),根據(jù)玻片的大小,先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起,造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過程注意無菌操作。

 

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

 

4.待細(xì)胞貼壁后,可去上清加含藥培養(yǎng)基。

 

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,張力較大,我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話,將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

 

 

 

 

【細(xì)胞爬片的固定】

 

細(xì)胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后再做固定。當(dāng)然,根據(jù)研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗,因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過程中有可能會(huì)脫落。

 

另外在保存細(xì)胞爬片的時(shí)候,我一般用培養(yǎng)皿或板,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標(biāo)記,為避免混淆,可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒有問題的。

 

以下為常用的固定液

 

1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心,丙酮在此溫度不會(huì)為固體的)細(xì)胞爬片取出后,PBS洗2遍,便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性,注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán),防止其揮發(fā))固定10分鐘。取出后,室溫吹干,然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%):可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 

主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原,例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存

 

3. 95%乙醇,可用于免疫組化。

優(yōu)點(diǎn):穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點(diǎn):但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過程中,溫育時(shí)間長,抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度

室溫固定15分鐘后,將表面液體吹干,入-20℃保存

 

4. 甲醛(福爾馬林)應(yīng)用zui廣 

優(yōu)點(diǎn):形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好,且穿透性強(qiáng),

缺點(diǎn): 甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結(jié)果。



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產(chǎn)品:

bs-0118R雄激素受體抗體|Androgen receptor
bs-2438R細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白抗體(凋亡、半胱胺酸蛋白酶激活抑制劑)|AVEN
bs-2439R軸蛋白1抗體|Axin1
bs-4011R自噬相關(guān)蛋白9B抗體|ATG9B
bs-4012R自噬相關(guān)蛋白12抗體|Apg12
bs-3864R自噬相關(guān)蛋白13抗體|ATG13
bs-4013R自噬相關(guān)蛋白3抗體|ATG3
bs-4191R整合素樣金屬蛋白酶與*4型抗體|ADAMTS4
bs-1648R磷酸化活化復(fù)制因子2抗體|phospho-ATF2 (Ser490/498)
bs-1649R磷酸化APP(Tyr757)淀粉樣肽前體蛋白抗體|phospho-Amyloid Precursor Protein (Tyr757)
bs-2919R*/*蛋白激酶ATR抗體|ACTR
bs-5849R去整合素樣金屬蛋白酶18抗體|ADAM18
bs-1634R活化轉(zhuǎn)錄因子6抗體|ATF6
bs-1546R銜接蛋白β抗體|AP2 beta
bs-1600R銜接蛋白γ/γ-Adaptin抗體|Gamma-Adaptin
bs-2060R水通道蛋白-9抗體|AQP9
bs-1631R膜粘連蛋白A3抗體|Annexin A3
bs-1564R膜粘連蛋白 A4抗體|Annexin IV
bs-12487R自噬相關(guān)蛋白8A抗體|APG8A
bs-3043R磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-Akt (Thr450)
bs-5551R磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1抗體|phospho-AMPK alpha-1 (Thr198)
bs-2720R磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-Akt(Thr308)
bs-15407R脫氧胞苷脫氨酶蛋白抗體|APOBEC3G
bs-13637R蛋白激酶錨定蛋白13抗體|AKAP13
bs-13638RAP-1μ2抗體|AP1M2
bs-7348R肥大細(xì)胞膜抑制性受體Allergin1抗體|Allergin-1
bs-4915R腦鈉通道蛋白1抗體|ACCN1
bs-10563R肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合亞單位B1抗體|ARP2/3 subunit 1B
bs-4780R三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2抗體|ABCG2
bs-8616R甲胎蛋白抗體|alpha 1 Fetoprotein
bs-1370R毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白抗體|ATM
bs-12441RATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抗體|ABCF2
bs-12442R肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白LIM蛋白3抗體|ABLIM3
bs-12443R酸性鈣調(diào)蛋白3抗體|Acidic Calponin
bs-12447R磷酸化CD156b抗體|phospho-ADAM17 (Thr735)
bs-12448R乙醇脫氫酶5抗體|ADH5
bs-12449R乙醇脫氫酶6抗體|ADH6
bs-12451R溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶5抗體|AGPAT5
bs-12452R遺傳性失明相關(guān)蛋白AIPL1抗體|AIPL1
bs-12453R免疫調(diào)節(jié)蛋白AIRE抗體|AIRE
bs-12456R磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Ser473)
bs-12458R磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Thr72)
bs-12459R磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Tyr326)
bs-12460R乙醛脫氫酶2型抗體|ALDH1A2
bs-12461Rγ-氨基丁酸醛脫氫酶抗體|ALDH9A1
bs-12462R衰老相關(guān)蛋白5抗體|AGPS
bs-12463R磷酸化熱休克蛋白β5/αb晶體蛋白質(zhì)/α-晶體蛋白b鏈抗體|phospho-alpha B Crystallin (Ser59)
bs-12467R釉基質(zhì)蛋白抗體|AMBN
bs-12468R磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體|phospho-AMPK alpha 2 (Ser176)
bs-12469R磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體|phospho-AMPK alpha 2 (Ser491)
bs-12471R磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser515)
bs-12472R磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser791)
bs-12473R磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser94)
bs-12474R磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Tyr363)
bs-12475R錨定蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白激酶ANKK1抗體|ANKK1
bs-12961R磷酸化內(nèi)收蛋白抗體|phospho-alpha Adducin (Thr445)
bs-12477R膜粘連蛋白11抗體|Annexin A11
bs-12478R膜粘連蛋白13抗體|Annexin A13
bs-12959R磷酸化促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH抗體|phospho-ACTH (Ser168)
bs-12962R磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Ser246)
bs-15963R磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-AKT1/3 (Tyr473)
bs-15967R磷酸化鈉鉀ATP酶蛋白a1抗體|phospho-alpha 1 Sodium Potassium ATPase (Tyr260) 
bs-15968R磷酸化內(nèi)收蛋白a1抗體|phospho-alpha Adducin(Ser436)

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