抗體與固相基質(zhì)共價結(jié)合的另一種常用方法是利用多種化學(xué)試劑使微珠活化，然后將純化的抗體與活化的微珠結(jié)合。這種方法有許多優(yōu)點(diǎn)，通?？梢栽诔降鞍踪|(zhì)能夠耐受的苛刻條件下使微珠活化，因此可以采用很多激活方法。此外，許多結(jié)合方法形成的交連，在范圍廣泛的變性條件下仍保持穩(wěn)定。另一個優(yōu)點(diǎn)是許多活性微珠有商品出售?？偟恼f來，商品化的微珠為免疫親和純化提供了較好的活化微珠。
1．準(zhǔn)備工作
應(yīng)用抗體柱對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化的主要特點(diǎn)是在足夠溫和的條件下就能將抗原從層析柱上洗脫，并能保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和／或功能不改變。洗脫的難易是由連接抗原與抗體之間結(jié)合鍵的類型和數(shù)量決定的。在制備大規(guī)模層析柱用于純化之前，有必要對所有可利用的抗體進(jìn)行測試，從中選擇適當(dāng)?shù)目贵w制備親和層析柱。
所制備的抗體緩沖液中不應(yīng)含有無關(guān)的化合物，因其可通過反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合到活性微珠上，這種結(jié)合反應(yīng)很可能就發(fā)生在抗體的氨基（或巰基）上。如果這些化合物是在抗體純化時使用，所制備的抗體必須對0．5mol／LPBS（pH7，5）結(jié)合緩沖液充分透析。
2．所需溶液、試劑和特殊設(shè)備
純化的抗體； 0．5mmol／L磷酸鈉（pH7．5）； 含1mol／LNaCi的0．05mol／L磷酸鈉溶液（pH7．5）； 100mmol／L乙醇胺（pH7．5） 搖床。
3．操作步驟
（1）用0．5mol／L（pH7．5）的磷酸鈉溶液將抗體配成所需濃度。留少量樣品供測定結(jié)合效率用。每次實(shí)驗(yàn)用于結(jié)合的抗體的量都不相同。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中每毫升微珠內(nèi)加10mg抗體可得到較高容量層析柱。
（2）加入按產(chǎn)品使用說明制備的活化的微珠
（3）置搖床上輕輕混合放室溫過夜。
（4）用0．5mol／L磷酸鈉（pH7．5）洗滌微珠2次。留取結(jié)合過夜的上清， 比較結(jié)合前、后樣本中的蛋白含量。
（5）用含1mol／LNaCl的0．05mol／L磷酸鈉溶液（PBS，pH7．5）洗滌微珠1次。
（6）加10倍體積的100retool／L乙醇胺（pH7．5）室溫下孵育4h或過夜，振蕩。
（7）用PBS洗滌2次，加入0．01％硫柳汞，免疫微珠可置4C貯存，數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。
制備好的微珠即呵用于抗原的免疫親和純化
常見問題
將抗體有效地結(jié)合到活性微珠上雖是——項(xiàng)簡單的工作，但保持抗體的活性常很困難?？贵w失活大多是由于抗體與微珠過度偶聯(lián)，或偶聯(lián)發(fā)生在抗體的抗原識別區(qū)。這兩種結(jié)果都會使抗體—微珠基質(zhì)結(jié)合抗原的能力顯著低于未偶聯(lián)的同量抗體。保持10％-50％的結(jié)合活性較為常見，并可認(rèn)為是活性良好水平。在偶聯(lián)過程中，如果抗體的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這一水平，可采取下列三種措施保持抗體活性。
*種控制失活的重要方法是在廣泛偶聯(lián)之前終止反應(yīng)，偶聯(lián)率可以在開始實(shí)驗(yàn)前測定。當(dāng)不到50％的抗體結(jié)合時即停止反應(yīng)，未結(jié)合的抗體不會受到損害，可以在其他實(shí)驗(yàn)中再使用，及早終止反應(yīng)可以控制每種抗體通過許多不同位點(diǎn)偶聯(lián)。終止結(jié)合反應(yīng)的恰當(dāng)時間可通過一個小規(guī)模的不同作用時間來確定。未偶聯(lián)的抗體可通過SDS隅聚丙烯酰胺凝膠電泳，和考馬斯亮藍(lán)染色來測定重鏈和輕鏈條帶。
第二種防止過度偶聯(lián)的方法是調(diào)整反應(yīng)的pH值以減慢偶聯(lián)速度。大多數(shù)偶聯(lián)方法是通過抗體上的氨基連接，而氨基基團(tuán)的反應(yīng)對pH值較敏感。如果抗體偶聯(lián)的pH值低于氨基基團(tuán)的pK值，大多數(shù)氨基基團(tuán)在任何時候都不會發(fā)生偶聯(lián)，這樣就控制了過度偶聯(lián)率。下述方法采用中性的pH值，有助于這一問題的解決。如果仍然出現(xiàn)過度偶聯(lián)，可以試用略低的pH值。選用合適的pH值需憑經(jīng)驗(yàn)通過多次試驗(yàn)才能確定，不同的抗體所需的條件也不一樣?？梢圆捎弥饾u降低pH值單位（如0．5）的方式來測試新的實(shí)驗(yàn)條件。另一方面，如果出現(xiàn)太低的偶聯(lián)率，可以增加緩沖液的pH值，延長偶聯(lián)時間。pH值在8．2以上時，可用0．5mol／L碳酸鹽緩沖液代替磷酸鹽緩沖液。
第三種減少過度偶聯(lián)問題的方法是將其他氨基基團(tuán)引入抗體偶聯(lián)反應(yīng)。在預(yù)備試驗(yàn)時，用不同濃度的帶有一級氨基基團(tuán)的小分子物質(zhì)阻斷抗體結(jié)合到微珠上。2種zui常用的化合物是乙醇胺和*。從中選一個適當(dāng)濃度的封閉劑使偶聯(lián)過程中只有約10％的抗體結(jié)合。選擇一個合理的起始濃度，建議抗體的zui終濃度不超過10mg／m1濕微珠。
zui后，所用的抗體可能有一個氨基基團(tuán)是分布在抗原結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)。這個位點(diǎn)與大多數(shù)活性微珠結(jié)合后特別容易失活。如果在偶聯(lián)反應(yīng)中，抗原結(jié)合能力不斷喪失，可改用蛋白A或蛋白G微珠，以及使用不依賴于氨基基團(tuán)的雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)。
會員1.png)