抗體與固相基質共價結合的另一種常用方法是利用多種化學試劑使微珠活化，然后將純化的抗體與活化的微珠結合。這種方法有許多優(yōu)點，通?？梢栽诔降鞍踪|能夠耐受的苛刻條件下使微珠活化，因此可以采用很多激活方法。此外，許多結合方法形成的交連，在范圍廣泛的變性條件下仍保持穩(wěn)定。另一個優(yōu)點是許多活性微珠有商品出售?？偟恼f來，商品化的微珠為免疫親和純化提供了較好的活化微珠。
1．準備工作
應用抗體柱對各種蛋白質進行親和純化的主要特點是在足夠溫和的條件下就能將抗原從層析柱上洗脫，并能保持蛋白質的結構和／或功能不改變。洗脫的難易是由連接抗原與抗體之間結合鍵的類型和數量決定的。在制備大規(guī)模層析柱用于純化之前，有必要對所有可利用的抗體進行測試，從中選擇適當的抗體制備親和層析柱。
所制備的抗體緩沖液中不應含有無關的化合物，因其可通過反應基團結合到活性微珠上，這種結合反應很可能就發(fā)生在抗體的氨基（或巰基）上。如果這些化合物是在抗體純化時使用，所制備的抗體必須對0．5mol／LPBS（pH7，5）結合緩沖液充分透析。
2．所需溶液、試劑和特殊設備
純化的抗體； 0．5mmol／L磷酸鈉（pH7．5）； 含1mol／LNaCi的0．05mol／L磷酸鈉溶液（pH7．5）； 100mmol／L乙醇胺（pH7．5） 搖床。
3．操作步驟
（1）用0．5mol／L（pH7．5）的磷酸鈉溶液將抗體配成所需濃度。留少量樣品供測定結合效率用。每次實驗用于結合的抗體的量都不相同。在大多數實驗中每毫升微珠內加10mg抗體可得到較高容量層析柱。
（2）加入按產品使用說明制備的活化的微珠
（3）置搖床上輕輕混合放室溫過夜。
（4）用0．5mol／L磷酸鈉（pH7．5）洗滌微珠2次。留取結合過夜的上清， 比較結合前、后樣本中的蛋白含量。
（5）用含1mol／LNaCl的0．05mol／L磷酸鈉溶液（PBS，pH7．5）洗滌微珠1次。
（6）加10倍體積的100retool／L乙醇胺（pH7．5）室溫下孵育4h或過夜，振蕩。
（7）用PBS洗滌2次，加入0．01％硫柳汞，免疫微珠可置4C貯存，數月內保持穩(wěn)定。
制備好的微珠即呵用于抗原的免疫親和純化
常見問題
將抗體有效地結合到活性微珠上雖是——項簡單的工作，但保持抗體的活性常很困難。抗體失活大多是由于抗體與微珠過度偶聯，或偶聯發(fā)生在抗體的抗原識別區(qū)。這兩種結果都會使抗體—微珠基質結合抗原的能力顯著低于未偶聯的同量抗體。保持10％-50％的結合活性較為常見，并可認為是活性良好水平。在偶聯過程中，如果抗體的活性遠遠低于這一水平，可采取下列三種措施保持抗體活性。
*種控制失活的重要方法是在廣泛偶聯之前終止反應，偶聯率可以在開始實驗前測定。當不到50％的抗體結合時即停止反應，未結合的抗體不會受到損害，可以在其他實驗中再使用，及早終止反應可以控制每種抗體通過許多不同位點偶聯。終止結合反應的恰當時間可通過一個小規(guī)模的不同作用時間來確定。未偶聯的抗體可通過SDS隅聚丙烯酰胺凝膠電泳，和考馬斯亮藍染色來測定重鏈和輕鏈條帶。
第二種防止過度偶聯的方法是調整反應的pH值以減慢偶聯速度。大多數偶聯方法是通過抗體上的氨基連接，而氨基基團的反應對pH值較敏感。如果抗體偶聯的pH值低于氨基基團的pK值，大多數氨基基團在任何時候都不會發(fā)生偶聯，這樣就控制了過度偶聯率。下述方法采用中性的pH值，有助于這一問題的解決。如果仍然出現過度偶聯，可以試用略低的pH值。選用合適的pH值需憑經驗通過多次試驗才能確定，不同的抗體所需的條件也不一樣?？梢圆捎弥饾u降低pH值單位（如0．5）的方式來測試新的實驗條件。另一方面，如果出現太低的偶聯率，可以增加緩沖液的pH值，延長偶聯時間。pH值在8．2以上時，可用0．5mol／L碳酸鹽緩沖液代替磷酸鹽緩沖液。
第三種減少過度偶聯問題的方法是將其他氨基基團引入抗體偶聯反應。在預備試驗時，用不同濃度的帶有一級氨基基團的小分子物質阻斷抗體結合到微珠上。2種zui常用的化合物是乙醇胺和*。從中選一個適當濃度的封閉劑使偶聯過程中只有約10％的抗體結合。選擇一個合理的起始濃度，建議抗體的zui終濃度不超過10mg／m1濕微珠。
zui后，所用的抗體可能有一個氨基基團是分布在抗原結合位點內。這個位點與大多數活性微珠結合后特別容易失活。如果在偶聯反應中，抗原結合能力不斷喪失，可改用蛋白A或蛋白G微珠，以及使用不依賴于氨基基團的雙功能交聯劑進行偶聯。
