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上海源葉生物科技有限公司
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閱讀:1164發(fā)布時(shí)間:2010-9-14
1.準(zhǔn)備工作
應(yīng)用抗體柱對(duì)各種蛋白質(zhì)進(jìn)行親和純化的zui主要特點(diǎn)是在足夠溫和的條件廠就能將抗原從柱上洗脫下來(lái),并能保持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和/或功能不改變。連接抗原和抗體的結(jié)合鍵的類型和數(shù)量是決定洗脫難易的關(guān)鍵。在制備大規(guī)模層析柱用于純化之前,有必要對(duì)所有可利用的抗體進(jìn)行測(cè)試,并從中選擇適當(dāng)?shù)目贵w制備親和層析柱。
建議不應(yīng)將抗體流經(jīng)含有微珠的層析柱,因?yàn)檫@樣會(huì)使抗體形成·個(gè)濃度梯度,從析柱1:而的濃度高,而下面的濃度低。為避免這種情況,應(yīng)將抗體與微珠混合成泥漿狀而使其結(jié)合。
2.所需的溶液、試劑和特殊設(shè)備
抗體;蛋白A或蛋白G微珠;0.2mol/ml硼酸鈉(pH9.0);二甲基庚二酸(DMP);PBS;0.2mol/L乙醇胺(pH8.0);考馬斯亮藍(lán);Laemmli樣品緩沖液;搖床。
3。操作步驟
(1)將抗體與蛋白A或蛋白G微珠結(jié)合,一般使用的層析柱,每毫升濕的微珠大約可結(jié)合2mg的抗體。將抗體與蛋白A/G微珠混合,使其成為一種稀薄的漿狀。在10ml溶液總量中大約含lml微珠。輕輕振蕩混勻,室溫孵育1h。
如前所述,免疫親和層析柱一般用單抗或經(jīng)過(guò)親和純化的多抗制備??梢杂貌煌瑏?lái)源的抗體,包括雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液、腹水或純化的抗體溶液, 由于與蛋白A/G微珠結(jié)合,可作為去除貯存緩沖液或交換緩沖液中其他物質(zhì)的步驟。
如果需知道與微珠結(jié)合抗體的準(zhǔn)確濃度,在與微珠結(jié)合之前應(yīng)對(duì)抗體進(jìn)行純化。
(2)用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉緩沖液(pH9.0)洗滌微珠2次,以3000g離心5min,或10 000g離心30s。
(3)用10倍體積的0.2mol/L硼酸鈉(pH9.0)重懸微珠,并取出相當(dāng)于10u1微珠的混懸液。加足量的DMP(固體)至終濃度為20retool/L。
如用DMP交聯(lián),應(yīng)為pH 8.3以上。
(4)輕輕混勻,室溫孵育30min,取出相當(dāng)于10txl已偶聯(lián)的微珠。
(5)用0.2mol/L乙醇胺洗滌微珠1次,以終止反應(yīng)。然后用0.2mol/L懸微珠,室溫孵育2h,輕輕混勻。
(6)再次洗滌后,用含0.01%硫柳汞的PBS重懸微珠。
(7)檢測(cè)微珠樣品與抗體結(jié)合前后的結(jié)合效率,將樣品分別加入Laemmli樣品緩沖液中煮沸。分別取出相當(dāng)于1/Il和9btl的兩種樣品,在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳,用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)合前樣品呈現(xiàn)重鏈區(qū)帶(分子質(zhì)量為55kDa)而結(jié)合后樣品則無(wú),表明交連成功
親和層析柱在含硫柳汞緩沖液中置4C可保存1年以上。制備好的微珠即可用于抗原的免疫親和純化。
凝膠結(jié)合效率
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