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上海源葉生物科技有限公司
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閱讀:1274發(fā)布時(shí)間:2010-9-25
BCIP/NBT是堿性磷酸酶zui常使用的呈色底物,堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑應(yīng)該用真核生物的堿性磷酸酶,因?yàn)檫@種酶容易被EDTA滅活。細(xì)菌酶難以終止其活性,易引起顯色過(guò)度,導(dǎo)致較高背景。
BCIP/NBT底物在酶結(jié)合位點(diǎn)形成強(qiáng)烈的黑紫色沉淀,此反應(yīng)是一個(gè)穩(wěn)定進(jìn)行的過(guò)程。因此,可設(shè)定一個(gè)的反應(yīng)對(duì)照??梢酝ㄟ^(guò)孵育時(shí)間的長(zhǎng)短控制反應(yīng)的敏感性。
1.需要的溶液和特殊設(shè)備
堿性磷酸酶緩沖液:100retool/L NaCl,5mmol/L MgCl2,100mmol/L Tris(pH9.5);
NBT溶液(0.5gNBT用10ml 70%DMF溶解,貯存在4C);
BCIP溶液(0.5gBCIP[二鈉鹽]用10m1100%DMF溶解,貯存在413);
20mmol/LEDTA用PBS溶解,DPX。
光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)
2.操作步驟
(1)細(xì)胞染色前,準(zhǔn)備3種貯存液:①NBT:用10ml 70%DMF溶解0.5gNBT;②BCIP:用10ml 100%DMF溶解0.5g BCIP[二鈉鹽兒③堿性磷酸酶緩沖液:100mmol/LNaCl,5mmol/LMgCl2,100mmol/LTris(pH 9.5)。所有的貯存液置4C可保存1年。
(2)實(shí)驗(yàn)前,底物液新鮮配制。加66/ul NBT貯存液至10ml堿性磷酸酶緩沖液中,充分混合,加33ul BCIP貯存液,在1h內(nèi)使用。
(3)將洗滌過(guò)的標(biāo)本片放在一個(gè)適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)。加足夠量的底物液覆蓋標(biāo)本片(3~5ml適合于100mm平皿)。在室溫中進(jìn)行反應(yīng)直到染色達(dá)到適當(dāng)黑色。對(duì)一些試劑可在顯微鏡下定期監(jiān)測(cè)。一般孵育時(shí)間大約是30min。
(4)在含有20mmol/LEDTA的PBS中漂洗以終止反應(yīng),螯合Mg2+。
(5)優(yōu)化:如果需要,進(jìn)行復(fù)染。
(6)用水沖洗,DPX封片。
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