BCIP／NBT是堿性磷酸酶zui常使用的呈色底物，堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑應(yīng)該用真核生物的堿性磷酸酶，因?yàn)檫@種酶容易被EDTA滅活。細(xì)菌酶難以終止其活性，易引起顯色過(guò)度，導(dǎo)致較高背景。
BCIP／NBT底物在酶結(jié)合位點(diǎn)形成強(qiáng)烈的黑紫色沉淀，此反應(yīng)是一個(gè)穩(wěn)定進(jìn)行的過(guò)程。因此，可設(shè)定一個(gè)的反應(yīng)對(duì)照?？梢酝ㄟ^(guò)孵育時(shí)間的長(zhǎng)短控制反應(yīng)的敏感性。
1．需要的溶液和特殊設(shè)備
堿性磷酸酶緩沖液：100retool／L NaCl，5mmol／L MgCl2，100mmol／L Tris（pH9．5）；
NBT溶液（0．5gNBT用10ml 70％DMF溶解，貯存在4C）；
BCIP溶液（0．5gBCIP[二鈉鹽]用10m1100％DMF溶解，貯存在413）；
20mmol／LEDTA用PBS溶解，DPX。
光學(xué)顯微鏡（通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果）
2．操作步驟
（1）細(xì)胞染色前，準(zhǔn)備3種貯存液：①NBT：用10ml 70％DMF溶解0．5gNBT；②BCIP：用10ml 100％DMF溶解0．5g BCIP[二鈉鹽兒③堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／LNaCl，5mmol／LMgCl2，100mmol／LTris（pH 9．5）。所有的貯存液置4C可保存1年。
（2）實(shí)驗(yàn)前，底物液新鮮配制。加66／ul NBT貯存液至10ml堿性磷酸酶緩沖液中，充分混合，加33ul BCIP貯存液，在1h內(nèi)使用。
（3）將洗滌過(guò)的標(biāo)本片放在一個(gè)適當(dāng)?shù)娜萜鲀?nèi)。加足夠量的底物液覆蓋標(biāo)本片（3～5ml適合于100mm平皿）。在室溫中進(jìn)行反應(yīng)直到染色達(dá)到適當(dāng)黑色。對(duì)一些試劑可在顯微鏡下定期監(jiān)測(cè)。一般孵育時(shí)間大約是30min。
（4）在含有20mmol／LEDTA的PBS中漂洗以終止反應(yīng)，螯合Mg2+。
（5）優(yōu)化：如果需要，進(jìn)行復(fù)染。
（6）用水沖洗，DPX封片。
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