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技術(shù)文章

辣根過氧化物酶標(biāo)記的試劑

閱讀:930發(fā)布時(shí)間:2010-9-25

底物范圍較廣,包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

二氨基聯(lián)苯胺/金屬鹽
DAB是辣根過氧化物酶zui敏感、常用的底物。它產(chǎn)生強(qiáng)烈的棕色產(chǎn)物,在水和醇中不溶解。多數(shù)情況下,推薦在DAB中加入不同的金屬離子。當(dāng)加入金屬鹽如鈷、鎳至底物液中,辣根過氧化物酶可以更加敏感。此類反應(yīng)產(chǎn)物呈暗藍(lán)灰色至黑色,且在水及醇中穩(wěn)定。DAB/金屬鹽染色應(yīng)用的組織染色范圍較廣。
1.需要的溶液和特殊設(shè)備
DAB,0.05mol/LTris緩沖液(pH7.6);
0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液;
30%過氧化氫;
DPX。
光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)
2.操作步驟
(1)用9ml 0.05mol/LTris緩沖液(pH7.6)溶解6mgDAB;
(2)加lml0.3%(W/V)氯化鎳/水貯存液(也可以用等量的氯化鈷替代);
(3)加0.1 m1 3%過氧化氫。過氧化氫一般以30%的溶液提供,貯存在4E,此條件可以持續(xù)1個(gè)月;
(4)如果出現(xiàn)沉淀,用濾紙過濾;
(5)加此溶液至標(biāo)本,并孵育1—20min水洗終止反應(yīng);
(6)優(yōu)化:如果需要可復(fù)染;
(7)用DPX封片。

氯萘酚
氯萘酚可以形成一種藍(lán)黑色產(chǎn)物。敏感性低于DAB,且產(chǎn)物可溶于醇中。它適用于當(dāng)DAB反應(yīng)形成較高背景或要求改變產(chǎn)物的顏色。
1.需要的溶液和特殊設(shè)備
0,03%氯萘酚,用無水乙醇溶解(貯存在-20℃),0.05mol/LTris(pH7.6)
過氧化氫;
Gelvatol或者M(jìn)owiol。
光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。
2.操作步驟
(1)氯萘酚貯存液的準(zhǔn)備:用10ml無水乙醇溶解0.3g氯萘酚,貯存于—20℃;
(2)加100ul氯萘酚貯存液至10ml 0.05mol/LTris(pH7.6),
(3)加0.1ml 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以30%的溶液提供,4℃可存放1個(gè)月;
(4)白色沉淀可用濾紙過濾去除;
(5)加此溶液到標(biāo)本中,并在室溫孵育10~40min,水洗終止反應(yīng);
(6)優(yōu)化:如果需要,進(jìn)行復(fù)染,但只可使用水溶性染料;
(7)用Gelvatol或者M(jìn)owiol封片。

氨乙基咔唑
氨乙基咔唑(AEC)產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,其敏感性低于DAB,但可用于DAB反應(yīng)產(chǎn)生較高背景或要求改變產(chǎn)物顏色的試驗(yàn)。此產(chǎn)物可溶于醇,但不溶于水。
1.需要的溶液和特殊設(shè)備
0.4%AEC用N,N—二甲基甲酰胺(DMF)溶解;
0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.2);
過氧化氫;
Gelvatol或Mowi01.
光學(xué)顯微鏡(通常帶有照相機(jī)以便于記錄結(jié)果)。
2.操作步驟
(1)用lmlDMF溶解4mgAEC。AEC在DMF中穩(wěn)定,因此,可以用100mlDMF溶解0.4gAEC作為貯存液備用;
(2)加lmlAEC溶液至15ml 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH5.2)中,并攪拌;
(3)加0.15ml 3%過氧化氫于水中。過氧化氫一般是30%的溶液提供,在4℃可存放1個(gè)月;
(4)用濾紙過濾;
(5)加此溶液到標(biāo)本中,并于室溫孵育10~40min,水洗終止反應(yīng);
(6)優(yōu)化:如果需要復(fù)染,只可用水溶性染料;
(7)用Gelvatol或Mowiol封片。

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