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技術(shù)文章

免疫印跡法檢測(cè)人類(lèi)免疫缺陷病毒

閱讀：323發(fā)布時(shí)間：2010-11-6

[測(cè)定方法] 免疫印跡法（或蛋白印跡法）
[方法學(xué)原理] 將純化的確診HIV蛋白抗原裂解，然后通過(guò)SDS-PAGE按分子量大小將其分離，再轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素薄膜上，并保存于4℃干燥試管內(nèi)，測(cè)定時(shí)將割成膜條的硝酸纖維素薄膜與待檢樣品反應(yīng)，使其充分接觸。若樣品中含有HIV抗體，將會(huì)與膜條上的抗原區(qū)帶結(jié)合，再加上酶標(biāo)抗人IgG抗體，經(jīng)過(guò)與底物反應(yīng)顯色，即可形成肉眼可見(jiàn)的不同區(qū)帶。
[標(biāo)本準(zhǔn)備] 靜脈抽血2ml，不抗凝。
[試劑]
1．轉(zhuǎn)印有HIV I型和Ⅱ型抗原的硝酸纖維素薄膜
2．酶聯(lián)結(jié)合物
3．底物及底物緩沖液
4．洗滌液
5．穩(wěn)定液
[測(cè)定步驟]
1．在免疫印跡法反應(yīng)槽內(nèi)，加入3ml洗滌液。加入待測(cè)樣品ul，混勻。
2．在反應(yīng)槽內(nèi)加入含HIV抗原的硝酸纖維素薄膜液，在室溫環(huán)境中振搖2h，每份樣品為l條。每次測(cè)定需附陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。在振搖過(guò)程中，應(yīng)使膜條帶有號(hào)碼的一面始終保持向上。
3．傾去槽內(nèi)的反應(yīng)液，用洗滌液將各膜條洗5次，每次3min。
4．在各反應(yīng)槽內(nèi)加酶聯(lián)試劑，于室溫環(huán)境中再振搖lh，用洗滌液洗4次，zui后用底物緩沖液洗1次。
5．將底物溶液配好后，加入反應(yīng)槽內(nèi)并振搖數(shù)分鐘，待陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型的HIV抗體陽(yáng)性區(qū)帶后，迅速傾去底物溶液，并加入穩(wěn)定液繼續(xù)振搖30min。然后將膜條取出，避光晾干，判斷結(jié)果。
6．結(jié)果判斷：確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果判定可根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)，即陽(yáng)性至少1條env帶和1條pol帶；或至少1條env帶和1條、gag帶；或至少1條env帶、1條gag帶和1條pol帶；或至少2條env帶；陰性：無(wú)病毒特異帶?？梢桑?條gag帶和1條pol帶，或只有g(shù)ag帶或poi帶。
[臨床意義] 免疫印跡法是目前*的確診HIV感染的方法，若檢出3個(gè)HIV主要基因（gag、poi、env）產(chǎn)物的抗體為陽(yáng)性時(shí)，可確診為HIV感染。
 


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