人E鈣粘蛋白(E-cad)ELISA試劑盒使用說明書
Human E-Cadherin(E-cad)ELISA Kit
實驗原理：
本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中E 鈣粘蛋白（E-cad）的含量。應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人E 鈣粘蛋白（E-cad）水平。用純化的人E 鈣粘蛋白（E-cad）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入E 鈣粘蛋白（E-cad）抗原，再與HRP 標記的E 鈣粘蛋白（E-cad）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的E 鈣粘蛋白（E-cad）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中人E 鈣粘蛋白（E-cad）
濃度。
樣本處理：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20 分鐘后，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次
離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞
濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20 分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器
將標本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待
檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上
進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10 孔，在*、第二孔中分別加標
準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，
混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各
取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混
勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，
濃度分別為240ng/L，160ng/L ，80ng/L，40ng/L，20ng/L）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣
品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣
品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混
勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
5. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此
重復(fù)5 次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯
色10 分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應(yīng)在加終止
液后15 分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值
大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。本試劑不同批號組分不得混用。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
結(jié)果計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.92 以上。
2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15%
檢測范圍：10ng/L -300ng/L
試劑盒保存：2-8℃
有效期：6 個月
