1．多肽合成的基本原理
多肽固相合成法是多肽合成化學(xué)的一個(gè)重大的突破。它的zui大特點(diǎn)是不必純化中間產(chǎn)物，合成過(guò)程可以連續(xù)進(jìn)行，從而為多肽合成的自動(dòng)化奠定了基礎(chǔ)。目前全自動(dòng)多肽的合成，基本都是固相合成。基本過(guò)程如下：
基于Fmoc化學(xué)合成，先將所要合成的目標(biāo)多肽的C-端氨基酸的羧基以共價(jià)鍵形式與一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點(diǎn)，同期它的氨基酸的羧基（已經(jīng)活化）作用形成肽鍵，不斷重復(fù)這一過(guò)程，即可得到目標(biāo)多肽。根據(jù)多肽的氨基酸組成不同，多肽后處理方式不同，純化方式也有差異。
2．關(guān)于Antigen Grade 多肽必須在在多肽的一端增加 Cysteine嗎？
答：不一定，偶連的方式與偶連的活化劑和氨基酸組成有關(guān)。EDC: 通過(guò)C端 COOH連接，一般要求序列中無(wú)Glu (E), Asp (D),或an amidated C-terminus；Act. EDC Method: 通過(guò) N端的氨基偶連，要求序列中無(wú)Lys (K) 或N端沒有被乙酰化；MBS:通過(guò)Cys的基團(tuán)載體中其他 SH連接形成 S-S. 如果序列中無(wú) Cys,就需要添加Cys基團(tuán)，增加在N端。
3．制備多肽抗體，常用的載體有那些？如何選擇？
答：多肽分子量很小，免疫應(yīng)答效果差,需要與載體偶連以提高免疫源性。載體大多數(shù)為高分量的蛋白質(zhì)，常用的載體有KLH (銅藍(lán)蛋白)，BSA, OVA等。KLH為。 ELISA測(cè)定多肽抗體效價(jià)時(shí)，有些多肽直接包板有困難，需要與BSA等偶連后再包板。
4．做免疫用的多肽多長(zhǎng)為合適？答：10-15個(gè)氨基酸，當(dāng)然長(zhǎng)一些免疫效果好一些，不過(guò)合成費(fèi)用會(huì)上去。10aa以下的多肽免疫效果比較差。
5．為什么多肽抗體有時(shí)不能用于Western Blot?
答：這比較常見，Elisa一般都沒有什么問題。
6．免疫用多肽的純度要很高嗎？
答：純度高當(dāng)然好，但是代價(jià)也高。問題是如果純度為90-95%的多肽能產(chǎn)生抗體，65-75%純度的多肽，一般也不對(duì)失敗。
7．我們合成的多肽溶解性如何？
答：很難準(zhǔn)確預(yù)測(cè)一個(gè)多肽的溶解性及合適的溶劑是什么。如果多肽難以溶解就認(rèn)為多肽合成有問題就大錯(cuò)特錯(cuò)了。那么如何判斷多肽的溶解性？
8．多肽狀態(tài)如何？如何保存儲(chǔ)存？
答：我們提供的多肽是粉末狀，一般為灰白色，組成不同，多肽粉末的顏色有差異。多肽一般需要避光保存。長(zhǎng)期保存應(yīng)保存在-20度，短期可以保存在4度?？梢远虝r(shí)間室溫運(yùn)輸。
9．多肽的量是怎么確定？
答：一般用天平直接稱重。
10．如何溶解多肽？
答：溶解多肽是非常頭痛的事情，一般很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一點(diǎn)試一試，在沒有確定合適的溶劑前千萬(wàn)不要全部溶解。
下列方法有助于您選擇合適的溶劑。
（1）判定多肽的電荷特定，設(shè)定酸性氨基酸Asp (D), Glu(E)和C端COOH為-1；堿性氨基酸Lys(K),Arg(R), His (H)及N端NH2為+1，其他氨基酸的電荷為0。計(jì)算出凈電荷數(shù)。
（2）如果凈電荷數(shù)>0,多肽為堿性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸（10%以上）；如果多肽還不能溶解，加入少量 TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。
（3）如果凈電荷數(shù)<0,多肽為酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀釋。
（4） 如果凈電荷數(shù)＝0,多肽為中性，一般需要用有機(jī)溶劑如乙腈，甲醇或異丙醇，DMSO等溶解。還有人建議需要假如尿素等溶解疏水性很大的多肽。
11．不同純度級(jí)別多肽的使用領(lǐng)域是什么？
答：不同純度級(jí)別多肽的使用領(lǐng)域并不相同。
(1) 粗品和脫鹽級(jí)別的純度和多肽的長(zhǎng)度有關(guān)，F(xiàn)moc固相多肽合成每個(gè)氨基酸的偶 連效率在95%以上，下表列出了每步合成的產(chǎn)率，可以幫助您判定粗品和脫鹽級(jí) 別是否適合您的用途，從而節(jié)省開支。
長(zhǎng)度 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
合成效率> % 95 90 85 81 77 73 69 66 62 59 56 53
長(zhǎng)度 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
合成效率> % 50 48 45 43 41 40 37 35 37 35 33 32
(2)多肽合成有一個(gè)重要的用途是用來(lái)免疫抗體，一般情況下免疫級(jí)65-75%左右純 度的多肽就達(dá)到免疫的要求。如果純度為90-95%的多肽能產(chǎn)生抗體，65-75%純 度的多肽，一般也不會(huì)失敗。純度高當(dāng)然好，但是代價(jià)高時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。Elias 測(cè)定抗體效價(jià)時(shí)，同樣70%左右的純度就可以滿足。
（3）研究級(jí)80%以上純度的多肽可以用于酶底物定性研究、體外生物活性分析，免 疫封閉、磷酸化研究、親和層析，單抗制備等研究
（4）90%以上的純度可以用于包括細(xì)胞體內(nèi)外活性分析，定量分析等大多數(shù)研究。 NMR研究的純度需要達(dá)到95%以上。
12． 非HPLC純化的多肽中有那些雜質(zhì)？
答：粗品和脫鹽級(jí)別的多肽中多肽和非多肽類雜質(zhì)：如非全長(zhǎng)肽和多肽后處理的一 些原料如DTT、TFA等。
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13． HPLC純化的多肽有那些雜質(zhì)？
答： 經(jīng)過(guò)HPLC純化的多肽，即使是簡(jiǎn)單的純化，其中的雜質(zhì)主要是短肽和微量
14．多長(zhǎng)的多肽為合適？
答：根據(jù)多肽合成需要多肽的長(zhǎng)度，電荷，親疏水性等因素。長(zhǎng)度越長(zhǎng)，合成粗品的純度和產(chǎn)率都隨著降低，純化的難度和無(wú)法合成的幾率就會(huì)大些。當(dāng)然多肽功能區(qū)的序列是無(wú)法改變的，但是為了多肽的順利合成，有時(shí)不得不在功能取的上下游增加一些輔助氨基酸，以改善多肽的溶解性和親疏水性。如果多肽太短，合成也可能有問題，主要問題是合成的多肽在后處理過(guò)程中有一定的難度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否則后處理難度加大。15個(gè)氨基酸殘基以下的多肽一般都可以得到滿意的產(chǎn)率和得率。
15．如何從多肽序列中判定多肽的溶解性？
（1） 多肽中如果含有高比例的疏水性很強(qiáng)的氨基酸如Leu, Val, Ile, Met, Phe 和 Trp，多肽很難溶解與水性溶液中或根本不可能溶解。這些氨基酸無(wú)論是純化或合成，都有可能有問題。
（2） 一般情況下疏水性氨基酸的比例<50%, 不能連續(xù)5個(gè)連續(xù)aa為疏水性，帶電荷的氨基酸的（正電荷K, R, H, N-terminus，負(fù)電荷 D, E, C-terminus）的比例達(dá)到20%，在多肽的N或C短如果能增加極性氨基酸，也可以改善溶解性。 ]
16．為什么含有Cys, Met, 或 Trp的多肽難合成？
答：含有Cys, Met, 或 Trp的多肽難以合成，同時(shí)難以獲得高純度的產(chǎn)品。主要因?yàn)檫@些基團(tuán)不穩(wěn)定，易氧化。這些多肽的使用和儲(chǔ)存都需要特別注意，避免反復(fù)開啟蓋子。
17．為什么有些多肽的合成產(chǎn)率或純度會(huì)比較低？
答：多肽合成與引物合成有比較大的區(qū)別，不能的引物合成很少，但是不能合成的多肽經(jīng)常有。如Val, Ile, Tyr, Phe, Trp, Leu, Gln, 和Thr這些氨基酸比鄰或重復(fù)時(shí)，多肽鏈在合成過(guò)程中不能*舒展溶解，合成效率下降。下列幾種情形，合成效率和產(chǎn)物的純度都比較低：重復(fù) PRO，Ser-Ser, 重復(fù)Asp, 4個(gè)連續(xù) Gly等。
18．多肽是如何純化的？
答：多肽純化一般使用反相柱（如C8, C18等），214nm。制備多肽時(shí)可以根據(jù)需要使用制備和半制備柱。緩沖體系通常為含TFA的溶劑，pH2. Buffer A為0.1% TFA 去離子水配制，Buffer B為.1% TFA /ACN /pH 2。純化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用buffer B溶解后，然后用Buffer A稀釋；對(duì)疏水性強(qiáng)的多肽，有時(shí)還需要加入少量的Formic Acid或醋酸。 HPLC分析多肽粗品，如果多肽不長(zhǎng)（1a以下），一般有主峰，主峰通常為全長(zhǎng)產(chǎn)物；對(duì)于20 aa以上的長(zhǎng)肽，如果沒有主峰，HPLC和MS必須結(jié)合起來(lái)，判定分子量，從而確定哪個(gè)峰是目標(biāo)多肽。
19．含 Cys的多肽如何處理？
答：含Cys 的多肽比較容易氧化。多肽純化過(guò)程中一般都是在pH2的酸性條件性完成的，這種條件下Cys 的SH,基本保持還原狀態(tài)，不需要特殊的后處理。當(dāng)然含 Cys的多肽會(huì)慢慢的氧化，氧化的速度取決于保存條件和序列組成。如果是需要 cys形成S-S，純化一般需要在堿性或中性條件下純化。
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