操作步驟

1）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl₂法)

      (1) 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落，接種于3～5ml LB液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將該菌懸液以1:100～1:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔20～30min測(cè)一次OD600nm，至OD600nm≤0.5時(shí)停止培養(yǎng)；
      (2) 每組取培養(yǎng)液3個(gè)2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中，在冰上冷卻20-30min，于4℃，4000r／min離心10min（從這一步開始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）；
      (3) 倒凈上清培養(yǎng)液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰?。?br />      (4) 0～4℃，4000r／min離心10min；
      (5) 棄去上清液，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細(xì)胞。0～4℃，4000r／min離心10min；
      (6) 棄去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl₂溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；
      (7) 制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于1.5ml離心管中，置于-70℃條件下，可保存半年至一年。

2）細(xì)胞轉(zhuǎn)化 

      (1) 分別取3個(gè)100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作)，*組，加入10 µl重組質(zhì)粒DNA(體積不超過(guò)10µl) 100µl感受態(tài)細(xì)胞，此管為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。第二組，插入DNa 片段對(duì)照組，即酶切后DNa 片段25ng 100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒DNA對(duì)照組，即1ng 未酶切pBluescript 質(zhì)粒DNA十100µl感受態(tài)細(xì)胞懸液。
      (2) 將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min
      (3) 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到0.5ml，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min ，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。

3) 平板培養(yǎng)（有時(shí)需要稀釋）

      (1) 取各樣品培養(yǎng)液0.1ml，分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂勻（如果用玻璃棒涂抹，酒精燈燒過(guò)后稍微涼一下再用，不要過(guò)燙）。
      (2) 菌液*被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(12-16小時(shí))，待菌落生長(zhǎng)良好而又未互相重疊時(shí)停止培養(yǎng)，對(duì)于可以藍(lán)白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來(lái)說(shuō)，此時(shí)應(yīng)該能清楚地看到藍(lán)色和白色菌落。

用 CaCl₂法制備的感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒  DNA產(chǎn)生5×10⁶-2×10⁷個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。在實(shí)際工作中，每微克有10⁵以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實(shí)驗(yàn)。

4) 檢出轉(zhuǎn)化體和計(jì)算轉(zhuǎn)化率
      統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況應(yīng)如表所示：
      各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況及結(jié)果分析

      轉(zhuǎn)化體總數(shù)＝菌落數(shù)×（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積）
              插入頻率＝藍(lán)色菌落數(shù)/白色菌落數(shù)
              轉(zhuǎn)化頻率＝轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA的量（計(jì)算出每微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）