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大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗

時間:2014-7-3閱讀:944
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操作步驟

1)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(CaCl2法)

      (1) 從新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一單菌落,接種于3~5ml LB液體培養(yǎng)中,37℃振蕩培養(yǎng)12h左右,直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1:100~1:50轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩擴大培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后,每隔20~30min測一次OD600nm,至OD600nm≤0.5時停止培養(yǎng);
      (2) 每組取培養(yǎng)液3個2ml轉(zhuǎn)入2ml離心管中,在冰上冷卻20-30min,于4℃,4000r/min離心10min(從這一步開始,所有操作均在冰上進行,速度盡量快而穩(wěn));
      (3) 倒凈上清培養(yǎng)液,用1ml冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液輕輕懸浮細胞,冰?。?br />      (4) 0~4℃,4000r/min離心10min;
      (5) 棄去上清液,加入500µll冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心懸浮細胞。0~4℃,4000r/min離心10min;
      (6) 棄去上清液,加入100µl冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心懸浮細胞,冰上放置片刻后,即制成了感受態(tài)細胞懸液;
      (7) 制備好的感受態(tài)細胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗,也可加入占總體積15%左右高壓滅菌過的甘油,混勻后分裝于1.5ml離心管中,置于-70℃條件下,可保存半年至一年。

2)細胞轉(zhuǎn)化 

      (1) 分別取3個100µl感受態(tài)細胞懸液(如是冷凍保存液,則需化凍后馬上進行下面的操作),*組,加入10 µl重組質(zhì)粒DNA(體積不超過10µl) 100µl感受態(tài)細胞,此管為轉(zhuǎn)化實驗組。第二組,插入DNa 片段對照組,即酶切后DNa 片段25ng 100µl感受態(tài)細胞懸液;第三組,質(zhì)粒DNA對照組,即1ng 未酶切pBluescript 質(zhì)粒DNA十100µl感受態(tài)細胞懸液。
      (2) 將以上各樣品輕輕搖勻,冰上放置20-30min,于42℃水浴中保溫1-2min,然后迅速冰上冷卻2min
      (3) 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養(yǎng)基(不需在冰上操作),使總體積到0.5ml,該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液,搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min ,使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài),并使轉(zhuǎn)化體表達抗生素基因產(chǎn)物(Ampr)。

3) 平板培養(yǎng)(有時需要稀釋)

      (1) 取各樣品培養(yǎng)液0.1ml,分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上,涂勻(如果用玻璃棒涂抹,酒精燈燒過后稍微涼一下再用,不要過燙)。
      (2) 菌液*被培養(yǎng)基吸收后,倒置培養(yǎng)皿,于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(12-16小時),待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養(yǎng),對于可以藍白斑篩選的質(zhì)粒和菌株來說,此時應(yīng)該能清楚地看到藍色和白色菌落。

用 CaCl2法制備的感受態(tài)細胞,可使每微克超螺旋質(zhì)粒  DNA產(chǎn)生5×106-2×107個轉(zhuǎn)化菌落。在實際工作中,每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實驗。

4) 檢出轉(zhuǎn)化體和計算轉(zhuǎn)化率
      統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù),各實驗組培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀況應(yīng)如表所示:
      各實驗組在培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長狀況及結(jié)果分析

 

      轉(zhuǎn)化體總數(shù)=菌落數(shù)×(轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積)
              插入頻率=藍色菌落數(shù)/白色菌落數(shù)
              轉(zhuǎn)化頻率=轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒DNA的量(計算出每微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù))

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