由于細菌感染而致病的各種標(biāo)本及帶菌者所需檢查的各種標(biāo)本,往往并非單一的細菌,而混有其它非致病菌(人體正常菌群)。因此當(dāng)對此標(biāo)本須作出細菌鑒定時,就必須從標(biāo)本中分離出致病菌,稱為細菌分離培養(yǎng)技術(shù)。另外,對已得到可疑病菌進行細菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng),稱為純培養(yǎng)接種技術(shù)。
(一)平板劃線接種法(又稱分離培養(yǎng)法)
平板劃線接種法為zui常用的分離培養(yǎng)細菌的方法,通過平板劃線后,可使細菌分散生長,形成單個菌落,有利于從含有多種細菌的標(biāo)本中分離出目的菌。平板分離劃線的方法較多,其中以分區(qū)劃線法與曲線劃線法較為常用。其目的都要使細菌呈現(xiàn)單個菌落生長,便于同雜菌菌落鑒別。現(xiàn)只介紹分區(qū)劃線法。
1、右手持接種環(huán),經(jīng)火焰滅菌,待涼后,挑取大腸桿菌(或葡萄球菌)培養(yǎng)物少許。
2、左手斜持瓊脂平板,皿蓋留在桌上,于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端,來回劃線,涂成薄膜(約占平板總表面積的 1/10),劃線時接種環(huán)與平板表面成30~40º角,輕輕接觸,以腕力在平板表面行輕快地滑移動作,接種環(huán)不應(yīng)劃破培養(yǎng)基表面。
3、燒灼接種環(huán),殺滅環(huán)上殘留細菌,待冷(是否冷卻,可先在培養(yǎng)基邊緣處試觸,若瓊脂溶化,表示未涼,稍等再試),從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線,約占平板表面1/5左右,再次燒灼接種環(huán),等三次平行劃線……以同樣方法作第四次,第五次劃線,將平板表面劃完。
4、劃線完畢,蓋上平皿蓋,底面向上,用標(biāo)簽或臘筆注明菌名檢驗號碼,接種者信息等,置37℃孵育培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。
(二)純培養(yǎng)細菌接種法(斜面培養(yǎng)基接種法:用于培養(yǎng),保存菌種及其它實驗用)
1、取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管,并排傾斜放在左手四指中拇指壓住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管的棉塞。(勿放置桌上,如棉塞太緊時應(yīng)預(yù)先松動)。
2、試管口部于火焰上往返通過2~3次滅菌,將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管中,取少量細菌(一般應(yīng)從斜面底部沾?。缓笮⌒囊浦翜蕚浣臃N的試管中。
3、接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線,若以保存菌為目的時可自管底上劃一粗直線即可。
4、取出接種環(huán),將試管上部再經(jīng)火焰滅菌,塞好棉塞,接種環(huán)滅菌后放回原處。
5、若自平皿培養(yǎng)物中取菌時,只應(yīng)沾取一個單個菌落。
6、接種菌應(yīng)作好標(biāo)記,標(biāo)明菌種名稱,日期等,置37℃溫箱中培養(yǎng),次日觀察結(jié)果。
液體培養(yǎng)基接種法:用于增菌及鑒定細菌生長特點,如表面生長,沉淀生長,均勻混濁生長等。操作技術(shù)基本與上法相同,只是接種時應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體表面之管內(nèi)壁輕輕摩擦(勿用力振蕩)使細菌混入培養(yǎng)基內(nèi),置37℃溫箱中培養(yǎng),次日觀察結(jié)果。
(三)半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法
用于保存菌種及間接觀察細菌之動力(無動力之細菌僅沿穿刺線生長,清晰可見;有動力的細菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣,穿刺線甚至難以看出)。
用無菌操作技術(shù),滅菌穿刺針沾取細菌后,垂直刺入半固體培養(yǎng)基*直達近管底處,再沿原穿刺線抽出即可,置37℃溫箱培養(yǎng),次日觀察結(jié)果。