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技術(shù)文章

包埋法固定化微生物問題初探(1)

閱讀:2398發(fā)布時間:2011-8-5

摘  要  本文概括介紹并比較了固定化技術(shù)的幾種主要的方法,并對目前筆者正在進行的包埋法固定化試驗中的兩個方法——海藻酸鈉包埋法和PVA—H3BO3包埋法做了一定的介紹和不同方法的比較。zui后,簡要介紹了固定化細(xì)胞的性能的評價以及該種技術(shù)的應(yīng)用和前景。
關(guān)鍵字 固定化 包埋法 海藻酸鈉  PVA—H3BO3  載體
1、引言
固定化微生物技術(shù)使用化學(xué)或物理手段,將游離細(xì)胞或者酶定位于限定的區(qū)域,使其保持活性并可反復(fù)利用的方法。zui初主要用于發(fā)酵生產(chǎn),70年代后期,被利用到水處理領(lǐng)域,近年來則成為各國學(xué)者研究的熱點。固定化微生物技術(shù)克服了生物細(xì)胞太小,與水溶液分離較難,易造成二次污染的缺點,保持了效率高、穩(wěn)定性強、能純化和保持菌種的優(yōu)點,在廢水處理領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。在實際應(yīng)用過程中,如何固定、何種載體,才能使固定化微生物能較長時間的保持一定的強度和活度,才能降低固定化成本,延長固定微生物的使用壽命,是該技術(shù)在污水處理中得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。
2、常用的固定化方法
廢水處理中常用微生物固定化方法主要有:包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法。
 2.1包埋法
包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中。通過聚合作用或者離子網(wǎng)絡(luò)形成,或通過沉淀作用,或改變?nèi)軇?、溫度、pH值使細(xì)胞截流。凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止細(xì)胞的泄漏,同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。
固定化微生物細(xì)胞的實用化對包埋載體的要求包括:
(1)    固定化過程簡單,易于制成各種形狀,能在常溫常壓下固定化;
(2)    成本低;
(3)    固定化過程中及固定化后對微生物無害;
(4)    基質(zhì)通透性好;
(5)    固定化細(xì)胞密度大;
(6)    載體內(nèi)細(xì)胞漏出少,外面的細(xì)胞難以進入;
(7)    物理強度和化學(xué)穩(wěn)定性好;
(8)    抗微生物分解;
(9)    沉降分離性好。
 在這些要求中,(1)和(2)涉及固定化細(xì)胞制備的成本;(3)~(6)針對固定化細(xì)胞的催化活性;而(7)~(9)則是出于對固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性的考慮。
2.2交聯(lián)法
交聯(lián)法是使用雙功能的試劑與酶分子進行分子間的交聯(lián)固定化方法。由于酶蛋白的功能團參與此反應(yīng),所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響,而使酶顯著失活。此外,交聯(lián)劑如戊二醛等價格昂貴,限制了其應(yīng)用。
2.3吸附法
又稱載體結(jié)合法,是通過物理吸附、化學(xué)或者離子的結(jié)合,將微生物固定于非水溶性載體。這種方法操作簡單,對微生物活力影響小,但所結(jié)合的微生物數(shù)量有限,反應(yīng)穩(wěn)定性和反復(fù)使用性差。主要分為物理吸附法、共價結(jié)合法、離子結(jié)合法和生物特異性吸附法四種方法。
2.4三種固定化方法的比較
盡管固定化方法多種多樣,但沒有一種理想的、普遍適用的方法。交聯(lián)法突出優(yōu)點是可以獲得很高的細(xì)胞密度,但由于缺乏良好的機械強度而不能得到廣泛的應(yīng)用。吸附法的固定操作簡單,條件溫和,而且載體可以再生;但是細(xì)胞與載體之間的結(jié)合力較弱,因此操作的穩(wěn)定性不好。包埋法有較好的綜合性能,催化活性保留和存活力都比較高,且包埋在反應(yīng)工程(包括反應(yīng)器的設(shè)計、操作穩(wěn)定性等)中應(yīng)用靈活,因此,包埋法成為整個固定化生物催化劑技術(shù)中應(yīng)用zui廣泛的固定化方法;但是包埋法的擴散阻力較大,使細(xì)胞的催化活性受到限制,且不適用于涉及大分子物質(zhì)的反應(yīng)。三種固定化方法總結(jié)于下表:
 
表一 三種固定化方法的比較

性   能
交聯(lián)法
吸附法
包埋法
制備的難易
結(jié)合力
活性表面
固定化成本
存活力
適用性
穩(wěn)定性
載體的再生
空間位阻
適中
適中
不能
較大
適中
適中
適中
適中
不能

 
3、包埋法固定化微生物的兩種方法舉例
天然高分子多糖類的海藻酸鈉,具有固定化成形方便,對微生物毒性小以及固定化密度高等優(yōu)點,但是其抗微生物分解性能較差,機械強度較低,同時*再高濃度的磷酸緩沖液的反復(fù)沖擊下,經(jīng)過一段時間,顆粒變軟、粘連。合成高分子化合物中常用的載體材料是*(polyvinyl alcohol 簡稱PVA),其突出優(yōu)點是抗微生物分解性能好,機械強度高,化學(xué)穩(wěn)定性能好。但是聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成條件比較劇烈,對微生物細(xì)胞的損害較大,而且成形的多樣性和可控性不好。下面將對這兩種包埋方法作一個簡單的介紹:
3.1海藻酸鈣包埋法
3.1.1原理
    海藻酸鈣包埋法是一種使用zui廣、研究zui多的包埋固定化方法,它具有固化、成形方便,對微生物毒性小,固定化細(xì)胞密度高等優(yōu)點。
海藻酸是用于包埋固定化微生物的*個聚合物,但是當(dāng)存在高濃度的K+、Mg2+、磷酸鹽以及其他單價金屬離子時,海藻酸鈣凝交的結(jié)構(gòu)會受到破壞。此外,由于海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙尺寸太大,酶可能會從網(wǎng)絡(luò)中泄露出來,因此不適合大多數(shù)酶的固定化。
海藻酸鹽是棕色藻類的胞內(nèi)產(chǎn)物,它由兩種不同類型的單糖組成,即1,4—β—D—甘露糖醛酸(M)和1,4—α—L—古洛糖醛酸(G)。海藻酸鹽是一種聚合物。
海藻酸鹽不能形成熱可逆性凝膠。通常是在其鈉鹽溶液中加入二價離子,如Ca2+,通過Ca2+取代Na+來形成凝膠網(wǎng)絡(luò)。凝膠的性質(zhì)與引入的二價陽離子及海藻酸鈉的類型(主要是兩種單糖的組成比例)有關(guān)。
二價陽離子對凝膠的機械強度有較大的影響,元素周期表的第二主族金屬離子于海藻酸鈉鹽形成的凝膠,其強度順序如下:
Ba2+>Sr2+>Ca2+>>Mg2+
利用*固定化微生物法安全、快速、制備簡單,反應(yīng)條件溫和,成本低廉且適用于大多數(shù)微生物的固定化。
3.1.2固定化方法
以海藻酸鹽為載體,建立包埋固定化微生物的方法如下:
方法I
①將海藻酸鈉加熱溶于水;
②將海藻酸鈉溶液與微生物細(xì)胞混合均勻,使海藻酸鈉zui終濃度為2%~4%;
③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%~10%的CaCl2溶液中,固定化7~8h;
④濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,備用。
方法 II
①將按方法I制得的固定化細(xì)胞顆粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中攪拌1~2h;
②濾出顆粒,水洗后,用0.5%戊二醛交聯(lián)5min;
③濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,備用。
方法III
①將按方法I制備的固定化顆粒浸泡于下列溶液中:
  殼聚糖 0.5%   CaCl2 0.2mol/L  pH 6.0
②濾出顆粒,水洗后,用0.5%戊二醛交聯(lián)5min;
③濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,備用。
 分別利用以上三種固定化方法,包埋黑曲酶細(xì)胞,比較各種固定化細(xì)胞的活性,其結(jié)果如表二:
 
                      表二 海藻酸鈣包埋法的比較
固定化方法
方法I
方法II
方法III
固定化細(xì)胞相對活性
57.1%
52.9%
44.8%
 
由表二可以看出,用海藻酸鈉系列包埋固定化方法固定化微生物,固定化細(xì)胞的活性較高。其中用方法I固定化細(xì)胞的活性zui高,在方法II、III中,由于在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜,雖然增強了固定化顆粒的機械強度,但是同時加大了底物及氧的擴散阻力,從而降低了細(xì)胞活性。此外,在方法II、III中所采用的戊二醛對細(xì)胞液具有毒性,在使用前應(yīng)作毒性試驗,確定是否采用改種交聯(lián)劑。
3.1.3海藻酸鈉包埋法固定化試劑對細(xì)胞活性的影響
(1)海藻酸鈉對細(xì)胞活性的影響
    海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類,對微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細(xì)胞的機械強度、質(zhì)量傳遞等,進而影響到微生物的活性。
海藻酸鈉濃度對固定化細(xì)胞活性的影響如表三所示。
 
表三 海藻酸鈉濃度對細(xì)胞活性的影響

海藻酸鈉濃度/%
細(xì)胞相對活性/%
成球難易
海藻酸鈉濃度/%
細(xì)胞相對活性/%
成球難易
1.0
56.2
2.5
52.3
1.5
57.1
3.0
45.6
較難
2.0
55.4
 
 
 


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