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技術(shù)文章

包埋法固定化微生物問(wèn)題初探(2)

閱讀:2449發(fā)布時(shí)間:2011-8-5

(2)CaCl2濃度細(xì)胞活性的影響
在海藻酸鈉包埋固定化過(guò)程中,凝膠化劑CaCl2中的Ca2+于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠,從而將細(xì)胞固定。CaCl2溶液的濃度對(duì)固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的影響見(jiàn)表四。
 
表四 CaCl2濃度對(duì)固定化細(xì)胞凝膠機(jī)械強(qiáng)度的影響
CaCl2濃度/%
2
3
4
5
10
機(jī)械強(qiáng)度
較好
較好
較好
 
隨著CaCl2濃度的增加,微生物細(xì)胞的活性降低。當(dāng)CaCl2濃度低于5%時(shí),細(xì)胞活性可以保持在80%以上;但是當(dāng)CaCl2濃度達(dá)到10%,細(xì)胞活性下降到60%左右,主要原因估計(jì)有兩種(i)由于鹽的滲析作用,引起細(xì)胞脫水,致使微生物活性部分喪失;(ii)在PCR技術(shù)中,CaCl2是使細(xì)胞處于感受態(tài)的物質(zhì),這個(gè)時(shí)候微生物是zui脆弱的,很容易被外界的干擾破壞。
從表四可以看出,CaCl2濃度對(duì)固定化細(xì)胞的機(jī)械強(qiáng)度影響較大。當(dāng)CaCl2濃度為2%~3%時(shí),固定化顆粒在使用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)膨脹,甚至出現(xiàn)裂縫活破碎現(xiàn)象。因此,海藻酸鈣包埋法固定化細(xì)胞活性較高。
3.2 PVA—H3BO3包埋法
3.2.1原理
*是一種新型的微生物包埋固定化載體,它具有機(jī)械強(qiáng)度高,化學(xué)穩(wěn)定性好,康微生物分解性能強(qiáng),對(duì)微生物無(wú)毒,價(jià)格低廉等一系列優(yōu)點(diǎn),是一種具有實(shí)用潛力的包埋材料,近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外獲得了較廣泛的研究。
*(polyvinyl alcohol,簡(jiǎn)稱(chēng)PVA)的結(jié)構(gòu)為:
 

    *在加熱后溶于水,在其水溶液中加入添加劑后發(fā)生凝膠化,或者在低溫下(-10℃)冷凍形成凝膠,從而將微生物包埋固定在凝膠網(wǎng)絡(luò)里。常用添加劑有硼酸和硼砂,在PVA水溶液中加入硼酸活著硼砂,由于化學(xué)反應(yīng)而形成凝膠。PVA于硼酸反應(yīng)形成的凝膠為單二醇型,與硼砂反應(yīng)形成的凝膠為雙二醇型,其結(jié)構(gòu)式如圖1(略)。
 
PVA于硼砂反應(yīng)形成凝膠時(shí),成形困難,凝膠呈海綿狀結(jié)構(gòu),強(qiáng)度較低。但硼砂的用量較硼酸用量低得多,所以值的進(jìn)一步研究。就目前的研究來(lái)看,大多采用H3BO3做交聯(lián)劑。
PVA—H3BO3包埋法是一種制備容易且價(jià)格低廉的固定化方法,其反應(yīng)原理如圖2(略)。
利用該方法制得的凝膠顆粒機(jī)械強(qiáng)度高,使用壽命長(zhǎng)且彈性好。
 3.2.2固定化方法
 以PVA為固定化載體,建立了利用PVA—H3BO3包埋固定化微生物細(xì)胞的方法,具體方法如下:
 方法I
①將*(PVA)加熱溶于水;
②將微生物細(xì)胞與PVA溶液混合均勻,使PVAzui終濃度為10%;
③將上述混合液滴入飽和的硼酸溶液中,放置10h,使其充分反應(yīng);
④濾出固定化顆粒,用生理鹽水洗凈,備用。
方法II
①將*(PVA)加熱溶于水,冷卻;
②將微生物細(xì)胞與PVA溶液混合均勻,使PVAzui終濃度為10%;
③將PVA與微生物細(xì)胞的混合液到入已滅菌的培養(yǎng)皿中,緩慢加入飽和硼酸溶液,浸泡10h;
④將凝膠切成3mm×3mm×3mm的小方塊,用生理鹽水洗凈,備用。
方法III
①將*(PVA)與海藻酸鈉加熱溶于水,冷卻;
②將微生物細(xì)胞與上述溶液混合均勻,使PVA與海藻酸鈉zui終濃度分別為7.5%~10%,0.4%~1.0%;
③將上述混合液用針形管滴入下列溶液中:
 H3BO3(飽和溶液) CaCl2 1.0%~5.0%  pH值4.0~7.0
④放置10h,使之充分反應(yīng);
⑤濾出顆粒,用生理鹽水洗凈,備用。
利用上述固定化方法,包埋固定化黑曲酶,比較了固定化細(xì)胞的活性,結(jié)果如表五所示。
 
表五 PVA—H3BO3法固定化的比較

固定化方法
方法I
方法I
方法III
固定化細(xì)胞相對(duì)活性/%
20.4%
23.1%
35.2%

 
從表五可以看出,采用方法III,即改進(jìn)的PVA—H3BO3法固定化細(xì)胞,其活性明顯提高,這是由于在方法III的固定化過(guò)程中,引入了少量的海藻酸鈉。海藻酸鈉作為一種多糖類(lèi)天然高分子化合物,對(duì)微生物細(xì)胞器一定的保護(hù)作用,減輕了硼酸對(duì)微生物的毒性作用,因此提高了固定化細(xì)胞的相對(duì)活性。
3.2.3 PVA—H3BO3法中固定化試劑對(duì)細(xì)胞活性的影響
(1)    PVA對(duì)細(xì)胞活性的影響
   一般來(lái)說(shuō),PVA的濃度對(duì)微生物細(xì)胞活性的影響不大,即使高達(dá)10%時(shí),對(duì)細(xì)胞活性也沒(méi)有明顯的不良影響。但是,PVA濃度增大,溶液的黏度隨之增大,使底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散,尤其是氧氣的傳遞受到影響,進(jìn)而影響細(xì)胞活性。
(2)    H3BO3對(duì)細(xì)胞活性的影響
   硼酸的細(xì)胞毒性比較大,因而其對(duì)微生物細(xì)胞活性的影響是導(dǎo)致PVA—H3BO3包埋固定化細(xì)胞活性底的主要原因。
4、固定化細(xì)胞性能的評(píng)價(jià)
4.1固定化顆粒的密度
固定化顆粒是指一定體積內(nèi)固定化顆粒的量, 因此,確定固定化顆粒的密度,也就是測(cè)定其體積和重量。但是由于固定化顆粒表面附著著一些水分,它不是固定化顆粒的組分,也無(wú)法通過(guò)過(guò)濾除去,可利用某些特殊溶劑(如葡萄糖)吸收,而這種溶劑不會(huì)擴(kuò)散到固定化顆粒內(nèi),該溶劑被稀釋的量即為附著的水量。這樣,測(cè)定固定化顆粒的總量以及附著的水量即可通過(guò)計(jì)算的出其體積、密度和重量。具體方法此處不再詳細(xì)敘述。
4.2固定化顆粒的通透性和機(jī)械強(qiáng)度
    固定化顆粒的通透性,也稱(chēng)為傳質(zhì)性能,是用來(lái)衡量的固定化細(xì)胞與外界交換能力的重要指標(biāo)。通透性越好,固定化細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換越容易,固定化微生物對(duì)于外界污染物的降解能力越強(qiáng)。
    機(jī)械強(qiáng)度,主要衡量固定化顆粒在外界的持續(xù)壓力沖擊下保持形狀的能力,一般來(lái)說(shuō),機(jī)械強(qiáng)度越大,顆粒可重復(fù)利用率越高,在工程上的應(yīng)用價(jià)值越大。
    但是,通透性和機(jī)械強(qiáng)度是一對(duì)矛盾。在固定化過(guò)程中,固定化時(shí)間越長(zhǎng),顆粒的機(jī)械強(qiáng)度越大,但是通透性卻降低;反之,固定化時(shí)間越短,通透性提高,機(jī)械強(qiáng)度卻無(wú)法保證。因此,在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該綜合考慮兩個(gè)因素,在兩個(gè)指標(biāo)中尋找*的組合。
4.3固定化顆粒的zui適溫度、zui適pH值
    固定化后的顆粒,由于在存在狀態(tài)上與游離的微生物不同,因此在zui適溫度和zui適pH值方面也會(huì)有很大的不同??梢酝ㄟ^(guò)做對(duì)照試驗(yàn),測(cè)出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率,從而找出*的降解的溫度和pH值。
    同時(shí)可以看到,在固定化以后,微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴(kuò)大。
4.4微生物的包埋量
    由于在制作固定化顆粒的過(guò)程中,不可避免的會(huì)有一部分微生物沒(méi)有包埋到顆粒之中,這部分微生物不會(huì)參加對(duì)污染物的降解,因而在一定程度上會(huì)影響降解的效果。 因此包埋量的測(cè)定也是評(píng)價(jià)固定化好壞的一個(gè)很重要的指標(biāo)。
    微生物的包埋量可以通過(guò)菌落技術(shù)的方法加以測(cè)定。
5、固定化微生物的發(fā)展趨勢(shì)
    微生物在自然界中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和環(huán)境凈化中起著非常重要的作用,微生物細(xì)胞是一個(gè)具有多種酶系統(tǒng)的統(tǒng)一體系,其本身就是一種天然的固定化酶反應(yīng)器,因此利用固定化方法將微生物具體細(xì)胞加以固定,則可以用于催化一系列生理生化反應(yīng),固定化細(xì)胞內(nèi)的酶體系十分穩(wěn)定,且不影響其催化活性,具有造作和貯藏的良好穩(wěn)定性。隨著科學(xué)技術(shù),尤其是生物工程以及工藝學(xué)的發(fā)展,開(kāi)發(fā)應(yīng)用固定化技術(shù)處理廢水,已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家、學(xué)者的重視,并且逐步實(shí)現(xiàn)其在工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用。
    固定化細(xì)胞技術(shù)易其*的優(yōu)點(diǎn)在廢水生物處理領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注,但是還有很多問(wèn)題亟待解決,未來(lái)的主要研究方向主要集中于以下幾點(diǎn):
(1)    固定化載體類(lèi)型以及包埋方式的研究;
(2)    尋找、廉價(jià)、抗毒性強(qiáng)的微生物;
(3)    開(kāi)發(fā)多種生物共生的固定化載體;
(4)    開(kāi)發(fā)具有良好流態(tài)的固定化反應(yīng)器;
(5)    協(xié)同固定化的研究。

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