PCR引物設(shè)計的原則
引物設(shè)計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)（即錯配）。
具體實現(xiàn)這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產(chǎn)物長度（product length），序列Tm 值（melting temperature），引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性（internal stability, 用?G 值反映），形成引物二聚體（primer dimer）及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實踐中的總結(jié)，引物設(shè)計應(yīng)注意如下要點：

1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[2]。
2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加[2]。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR 反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物[2]。
4. 引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復(fù)性條件*。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo 軟件中使用的是zui鄰近法（the nearest neighbor method） [6][7]。
6. ?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G 值較低（值不超過9），而5’端和中間?G 值相對較高的引物。引物的3’端的?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)[6]。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR 產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

[2] 擴增較大片段DNA的PCR方法
一般PCR方法在擴增大片段DNA時的局限性：
通常所用的PCR方法都在兩個方面有局限，即目標(biāo)產(chǎn)物程度和合成片段的大小。Pfu（Pyrococcus furiosus）DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個循環(huán)中堿基的錯配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。但它在擴增1.5-2.0kb片段時，效率比Klentaq l（Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全長的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴增5.0-7.0kb片段時亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯*之處。因而以往的PCR反應(yīng)產(chǎn)物限制在5.0kb以內(nèi)。超出這一范圍，PCR擴增反應(yīng)效率將明顯下降，同時產(chǎn)物會降解。即使將延伸時間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進(jìn)。
利用兩種DNA聚合酶進(jìn)行較大片段DNA的擴增
美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Barnes WM等對前述問題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，認(rèn)為：PCR反應(yīng)效率低zui主要的原因是由于錯配的堿基阻礙了延伸反應(yīng)的正常進(jìn)行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應(yīng)時間下；酶濃度較高時，反應(yīng)效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態(tài)，同時配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應(yīng)順暢進(jìn)行。實驗證實，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應(yīng)有效進(jìn)行。當(dāng)然，對于各種不同條件的反應(yīng)，兩種類型酶的*配比需要具體考慮。
控制脫嘌呤反應(yīng)增強擴增效率
在PCR反應(yīng)體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應(yīng)效率。DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環(huán)境中某些位點發(fā)生脫嘌呤反應(yīng)從而阻礙反應(yīng)的順利進(jìn)行。Lindahl和Nyberg的研究結(jié)果顯示：在70℃ pH7.4的條件下， 單鏈DNA脫嘌 呤反應(yīng)的速度是雙鏈DNA的4倍；100℃ pH7.0時，100kb的堿基中每分鐘將有1個位點脫嘌呤。這一反應(yīng)與緩沖體系中酸堿度的變化有關(guān)。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數(shù)（pKa）會隨溫度升高而改變，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時pH8.55的PCR反應(yīng)體系，到95℃熱變性時，pH值將變?yōu)?.45，這就很可能誘導(dǎo)脫嘌呤反應(yīng)。 為了解決這一問題，可以采取下列措施：
縮短熱變性時間，Barnes等在擴增35kb的大片段時，變性條件為95℃5秒，取得滿意結(jié)果；
盡可能使升溫、 降溫過程縮短，可選擇使用導(dǎo)熱性能*的薄壁反應(yīng)管及較為*的擴增設(shè)備；
適當(dāng)提高反應(yīng)體系的pH值，反應(yīng)zui初應(yīng)控制在pH8.8-9.2范圍；
適當(dāng)增加延伸時間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴增zui大為35kb的DNA片段，產(chǎn)物的準(zhǔn)確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現(xiàn)的DNA分子內(nèi)的堿基重排和可能的毒性危險等問題。

[3] PCR常見問題
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般為48h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。

假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性
出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增 時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽 性。需重新設(shè)計引物。
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交 叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止 將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標(biāo)本 前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污 染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴 增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引 物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產(chǎn)物
1）克隆PCR產(chǎn)物的*條件是什么？
*插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為*比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4oC過夜。

2）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？
A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。
例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：
1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C）如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑（用步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4）對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？
A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提率，需4oC過夜。
B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。
D）帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。
E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞。

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件
標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以zui低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U（指總反應(yīng)體積為100ul時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（ 等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板（靶基因）核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

PCR反應(yīng)條件的選擇
PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。

溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的zui主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。
②退火（復(fù)性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇zui適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）
復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結(jié)合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。