1、前言

在基因時(shí)代和蛋白質(zhì)時(shí)代，人們迫切需要一種具有高靈敏度和高親和力的生物分子探針，用以進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。1996年Tyagi和Kramer首先建立了分子信標(biāo)技術(shù)，很快這種技術(shù)就廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和化學(xué)等諸多領(lǐng)域。分子信標(biāo)技術(shù)具有*的特異性，而且操作簡便、靈敏度高，特別是它可以進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)、甚至可以用于活體分析。在臨床診斷、基因檢測(cè)等領(lǐng)域，分子信標(biāo)也越來越顯示出它的優(yōu)勢(shì)。近年來，人們對(duì)分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)作了諸多改進(jìn)，發(fā)展出很多具有更多特性的新型分子信標(biāo)。隨著分子信標(biāo)的發(fā)展，該技術(shù)也必將在更多領(lǐng)域中發(fā)揮出它的優(yōu)勢(shì)。

分子信標(biāo)技術(shù)是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象（FRET）和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則建立起來的一種分析技術(shù)。分子信標(biāo)作為一種熒光標(biāo)記的分子探針，具有*的特異性和較高的靈敏度，目前已經(jīng)成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的重要研究工具。本文著重介紹了分子信標(biāo)的基本原理及其應(yīng)用，并對(duì)其近年來的研究進(jìn)展做以簡單介紹。

2、分子信標(biāo)的原理

分子信標(biāo)是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈，一般含有25～35個(gè)核苷酸。在結(jié)構(gòu)上，分子信標(biāo)大體上可以分為三部分：（1）、環(huán)狀區(qū)：一般由15～30個(gè)核苷酸組成，可以與靶分子特異結(jié)合；（2）、莖干區(qū)：一般由5～8個(gè)堿基對(duì)組成，在分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合過程中可發(fā)生可逆性解離。（3）、熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)：熒光基團(tuán)一般連接在5ˊ端；淬滅基團(tuán)一般連接在3ˊ端，常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者距離的6次方成反比。所以只有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間達(dá)到一定的距離時(shí)才會(huì)產(chǎn)生熒光。

自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，從而熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相距較近（約7～10nm）。此時(shí)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎*被淬滅，熒光本底極低。當(dāng)分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離加大，從而，分子信標(biāo)的熒光幾乎100%恢復(fù)。而且所檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)量成正比。

 

3、影響分子信標(biāo)的主要因素

分子信標(biāo)中，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離是影響分子信標(biāo)的zui主要因素。根據(jù)Foerster理論，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)之間的距離直接影響熒光的強(qiáng)度。

另外，溫度也是影響分子信標(biāo)的一個(gè)重要因素。在較低溫度下，分子信標(biāo)才可以保持發(fā)卡結(jié)構(gòu)。在較高溫度下，分子信標(biāo)將無法保持其發(fā)卡結(jié)構(gòu)，甚至使其伸展為隨機(jī)線狀，造成熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。有文獻(xiàn)表明，其熔鏈溫度取決于莖干區(qū)的長度、G-C含量和緩沖液的離子強(qiáng)度。

Bonnet等研究溫度對(duì)分子信標(biāo)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，體系的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)為一個(gè)先減弱后增強(qiáng)的過程。就此，Bonnet等做出如下解釋：

 

在較低溫度下，分子信標(biāo)與靶標(biāo)結(jié)合呈S1狀態(tài)，發(fā)出熒光。隨著溫度升高，分子信標(biāo)與靶標(biāo)分離，分子信標(biāo)重新恢復(fù)為發(fā)卡式結(jié)構(gòu)即S2狀態(tài)，從而熒光強(qiáng)度減弱。溫度持續(xù)增高，將導(dǎo)致分子信標(biāo)熔鏈即S3狀態(tài)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，導(dǎo)致熒光恢復(fù)。

環(huán)境pH值也是影響分子信標(biāo)的一個(gè)因素。pH值過高，分子信標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可能被破壞，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。此外，分子信標(biāo)的純度，也將對(duì)分子信標(biāo)產(chǎn)生影響。

4、在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

zui初被用作PCR的熒光探針，它既可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，又可以對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)。近年來，隨著的發(fā)展和成熟，人們不斷開拓其應(yīng)用領(lǐng)域，目前，分子信標(biāo)不僅可以用于基因的定量、定性檢測(cè)，還可以用于基因點(diǎn)突變等的分析，將分子信標(biāo)與PNA-DNA-環(huán)技術(shù)結(jié)合，使檢測(cè)雙鏈DNA成為可能。另外，還為研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了一種簡單、直接、靈敏、實(shí)時(shí)、甚至可以用于活體檢測(cè)的方法。利用在分析、檢測(cè)核酸和蛋白質(zhì)中的優(yōu)點(diǎn)，還可以作為生物芯片和生物傳感器的探針。總之，已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的眾多領(lǐng)域。

4.1 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定靶標(biāo)濃度

在其出現(xiàn)之初就被用于實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定靶標(biāo)濃度。這一技術(shù)是基于熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。它是在常規(guī)的PCR的基礎(chǔ)上加入相應(yīng)的分子信標(biāo)，在PCR的每一循環(huán)過程中，都會(huì)發(fā)生分子信標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光，但這并不影響PCR的整個(gè)過程。并且只有能和分子信標(biāo)結(jié)合的DNA模板得到擴(kuò)增時(shí)才能產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以熒光強(qiáng)度與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，它是模板被PCR擴(kuò)增的直接標(biāo)志。與常規(guī)的核酸檢測(cè)方法相比，分子信標(biāo)可以進(jìn)行閉管操作，有效消除核酸的交叉污染，具有實(shí)時(shí)、定量、高靈敏度、高特異性等特點(diǎn)。

4.2 用于活體內(nèi)核酸的動(dòng)態(tài)檢測(cè)

通過將分子信標(biāo)注入活細(xì)胞內(nèi)，使分子信標(biāo)與特定的模板結(jié)合產(chǎn)生熒光?？梢酝ㄟ^熒光顯微鏡實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)整個(gè)過程。如可以用于細(xì)胞內(nèi)mRNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，以了解其在轉(zhuǎn)錄等過程中的變化。但活體內(nèi)存在大量的酶，其中某些酶可能導(dǎo)致分子信標(biāo)水解，使其結(jié)構(gòu)破壞產(chǎn)生熒光，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。PNA分子信標(biāo)可以很好的解決這一問題，PNA分子信標(biāo)可以有效的避免核酶的水解，使熒光強(qiáng)度能準(zhǔn)確反映活體內(nèi)的過程。

4.3 用于雙鏈DNA的檢測(cè)

與RNA不同，DNA是雙螺旋結(jié)構(gòu)，常規(guī)方法難以進(jìn)行檢測(cè)。而可用于雙鏈DNA分子的檢測(cè)。PNA與雙鏈DNA互補(bǔ)鏈結(jié)合時(shí)可以取代非互補(bǔ)鏈，使其解離成單鏈，形成P環(huán)結(jié)構(gòu)。解離后的DNA雙鏈及可用檢測(cè)，使分子信標(biāo)與DNA變性部分結(jié)合，從而出現(xiàn)熒光。

4.4 用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)組學(xué)，人們?cè)絹碓桨l(fā)現(xiàn)許多問題要到蛋白質(zhì)中去尋找答案。這就要求人們能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)各方面的性質(zhì)可以加以檢測(cè)。此外，人們把蛋白質(zhì)和核酸起來，研究蛋白質(zhì)和核酸之間的相互作用，這一課題已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究方法（如X單晶衍射、圓二色譜等技術(shù)）相比，具有簡單、靈敏的特點(diǎn)，又可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)，甚至可以用于活體檢測(cè)。

2001年，Tan等發(fā)表文章闡述了其應(yīng)用研究蛋白質(zhì)所取得的結(jié)果。他們用分子信標(biāo)來檢測(cè)單鏈結(jié)合蛋白，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光。所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較分子信標(biāo)與核酸結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度小，但其強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分子信標(biāo)與核酸發(fā)生錯(cuò)配時(shí)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)分子信標(biāo)不能與雙鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，產(chǎn)生熒光。

Nobuko Hamaguchi根據(jù)分子信標(biāo)的原理設(shè)計(jì)了Aptamer信標(biāo)，可以直接用來檢測(cè)蛋白質(zhì)。這一方法與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定蛋白質(zhì)相比，具有簡單、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。但這一方法不能用于檢測(cè)非特異性ssDNA結(jié)合蛋白，而且分子信標(biāo)的構(gòu)象受金屬離子影響很大，一些金屬離子的存在會(huì)干擾熒光信號(hào)的觀測(cè)。

4.5 用于基因的檢測(cè)

在基因時(shí)代，基因的檢測(cè)方法也取得了飛速發(fā)展。近年來，國內(nèi)外很多科學(xué)家嘗試用來檢測(cè)基因，并取得了初步的成果。人們將與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，初步實(shí)現(xiàn)了基因檢測(cè)的自動(dòng)化或半自動(dòng)化，使大面積、高通量篩選成為可能。

5、在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

5.1 在癌癥診斷中的應(yīng)用

2001年賓夕法尼亞大學(xué)的B.Chance 教授在美國物理學(xué)會(huì)上宣布，他和同事合作制得了可以用于癌癥診斷的分子信標(biāo)，并在老鼠體內(nèi)取得了初步的成功，已準(zhǔn)備做臨床實(shí)驗(yàn)。

他們首先將分子信標(biāo)注射到體內(nèi)，當(dāng)它與乳腺癌有關(guān)的生化酶發(fā)生作用時(shí)才會(huì)打開，否則就保持密封狀態(tài)。信標(biāo)打開后就會(huì)在體外裝置中的光束在近紅外處發(fā)生熒光響應(yīng)，從而探測(cè)到信標(biāo)的信號(hào)，由于信標(biāo)能發(fā)射大量的近紅外光，所以它可以通過人體。這種方法沒有離子輻射且價(jià)格便宜，其成本約為幾千美元。這種裝置的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它的工藝及實(shí)施以常用的光盤和單元為基礎(chǔ)的，從而簡便、易行。

5.2 用于SARS的診斷

2003年SARS病毒在中國內(nèi)地的出現(xiàn)以及在部分國家的肆意和傳播，給人類健康提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。許多國家的科研人員都在開發(fā)快速和檢測(cè)SARS病毒的方法和技術(shù)，諸如RT-PCR、ELISA、免疫熒光法等，并已經(jīng)在推出相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。但是，目前這些檢測(cè)仍然需要結(jié)合臨床體征的判斷，這主要是由于這幾種方法還存在著一些自身缺陷，比如RT-PCR對(duì)SARS檢測(cè)的靈敏性還不令人滿意，即有出現(xiàn)假陰性的傾向，曾報(bào)道有出現(xiàn)漏檢的情況發(fā)生；使用免疫熒光法和ELISA法的SARS抗體檢測(cè)也存在敏感性問題；其中免疫熒光法又只能在病人感染病毒10天以后才能檢測(cè)出抗體，而ELISA則要在20天以后才能檢測(cè)出抗體。

的基本原理應(yīng)用的是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，這就有效的保證了用此技術(shù)檢測(cè)SARS病毒的特異性。此外作為基因水平的檢測(cè)其靈敏性也較上述方法高。于上述方法需要再感染幾天后才能檢出相比，只要體內(nèi)有SARS病毒的核酸出現(xiàn)即可被檢出，從而為臨床治療贏得寶貴的時(shí)間，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

5.3 用于乙肝病毒的檢測(cè)

Yates等2001年在臨床微生物學(xué)雜志發(fā)表文章，提出了用檢測(cè)乙肝病毒的方法。該方法定量檢測(cè)HBV DNA，具有簡便、易行、可靠等優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。目前，國外已有成型的試劑盒出售，國內(nèi)也有類似產(chǎn)品。

6、前景與展望

自其誕生以來，由于它*的特異性、靈敏度等特點(diǎn)迅速進(jìn)入生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等各個(gè)相關(guān)領(lǐng)域。人們對(duì)分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了數(shù)次改進(jìn)和發(fā)展，使之可以在更廣的范圍內(nèi)發(fā)揮更大的作用。以為基礎(chǔ)人們開發(fā)出可進(jìn)行高通量篩選的芯片。如果該技術(shù)與納米技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)等其他*技術(shù)相結(jié)合，也必然會(huì)促進(jìn)的發(fā)展。毫無疑問的是有著廣闊的應(yīng)用空間。隨著制備技術(shù)的發(fā)展，設(shè)計(jì)方法的改進(jìn)必將更加完善。

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原文地址:/biotech/exp/PCR/2011/j820571379 （滬宇生物）