197．蘇州華宇牌超凈工作臺(tái)在人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定中的應(yīng)用

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

1. 1. 1 主要儀器及試劑倒置顯微鏡（ Olympus，日本） ，二氧化碳培養(yǎng)箱（ Thermo，美國） ，超凈工作臺(tái)（ 蘇州華宇） ，移液器（ Eppendorf，德國） ，染色體核型分系統(tǒng)（ Cytovision，AI，UK） ，流式細(xì)胞儀（ BD，美國） ，胎牛血清（ FBS，Gibco） ，L － DMEM（ Invitrogen） ，青/鏈霉素，Antibiotic（ Invitrogen） ， IV型膠原酶（ Collagenase IV，Gibco ） ，Dispase Ⅱ（ Roche） ，L － 谷氨酰胺（ Invitrogen） ，鼠抗人單克隆抗體IgG2a － FITC， IgG1 － PE，CD29 － PE，CD34 －PE，CD44 － FITC，CD105 － FITC（ 均為BD 公司生產(chǎn)） ，植物細(xì)胞凝集素（ Phaseolus vulgaris agglutinin

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的分離剪取胎盤絨毛膜面1 ～ 2cm 厚的組織，剪成1mm × 1mm × 1mm 的碎塊，用PBS 漂洗至無色，用240U·mL － 1 DispaseⅡ和270U·mL － 1 Collagenase IV 37℃ 水浴消化1h，振蕩后靜置1min，使液體自然分為三層，吸取中間層懸液于離心管中，加入PBS，搖勻后700r·min － 1離心5min，棄上清，加入3mL 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸沉淀，700r·min － 1 離心5min，棄上清。加入適量培養(yǎng)液混勻，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 2 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞的繼代培養(yǎng)細(xì)胞生長至80%時(shí)，進(jìn)行胰酶消化傳代。傳代時(shí)，以0. 25% 胰蛋白酶消化3 ～ 4min，加細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，700r·min － 1離心10min，棄消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液吹打混勻，收集細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1. 2. 3 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞干細(xì)胞特異性抗原的鑒定選取處于指數(shù)生長期的第三代及凍存復(fù)蘇后正常生長中的胎盤間充質(zhì)細(xì)胞，用0. 25% 胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞懸液于離心管中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 105·μL － 1 ; 取6 只試管，每管分別加15μL鼠抗人單克隆抗體CD29 － PE、CD34 － PE、CD44 －FITC、CD105 － FITC，以鼠抗人IgG2a － FITC、IgG1 － PE 作為陰性對(duì)照，再分別加入150μL 細(xì)胞懸液混勻，室溫避光放置10min，之后再用PBS 洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Cellquest 軟件獲取與分析。

1. 2. 4 胎盤間充質(zhì)細(xì)胞染色體核型分析用秋水仙素（ 終濃度為0. 05μg·mL － 1 ） 分別處理第二代和第十四代的胎盤間充質(zhì)細(xì)胞2h 后收集細(xì)胞，用0. 075mol·L － 1 的KCl 溶液5mL 低滲處理細(xì)胞30min，固定、制片。將制片標(biāo)本置65℃烘烤3h，室溫存放3 ～ 7d。37℃ 0. 25% 胰蛋白酶溶液中預(yù)處理10 ～ 20s，然后用GKN 液和自來水依次漂洗數(shù)秒，立即用Giemsa 染液染色10 ～ 15min，封片，顯微鏡下觀察并作染色體核型分析。