1  范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌（lactic acid bacteria）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。

2  規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是*的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3  術(shù)語和定義

3.1  乳酸菌 lactic acid bacteria

    一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）。

4  設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

4.1  恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃±1 ℃。

4.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。

4.3  均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。

4.4  天平：感量0.1 g。

4.5  無菌試管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。

4.6  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。

4.7  無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。

5  培養(yǎng)基和試劑

5.1  MRS（Man Rogosa Sharpe）培養(yǎng)基及*鋰鹽（Li-Mupirocin）改良MRS培養(yǎng)基：見附錄A中A.1。

5.2  MC培養(yǎng)基（Modified Chalmers 培養(yǎng)基）：見附錄A中A.2。

5.3  0.5%蔗糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.4  0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.5  0.5%麥芽糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.6  0.5%*發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.7  0.5%水楊苷發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.8  0.5%*發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.9  0.5%乳糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。

5.10 七葉苷發(fā)酵管:見附錄A中A.4

5.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.5。

5.12 *鋰鹽（Li-Mupirocin）：化學(xué)純。

5.13 半*鹽酸鹽（Cysteine Hydrochloride）：純度＞99%。

6  檢驗(yàn)程序

乳酸菌檢驗(yàn)程序見圖1。

7  操作步驟

7.1樣品制備

7.1.1  樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。

7.1.2  冷凍樣品可先使其在2 ℃～5 ℃條件下解凍，時間不超過18 h，也可在溫度不超過45 ℃的條件解凍，時間不超過15 min。

7.1.3  固體和半固體食品：以無菌操作稱取25 g樣品，置于裝有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000 r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，制成1:10樣品勻液；或置于225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min制成1:10的樣品勻液。

7.1.4  液體樣品：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。

7.2  步驟

7.2.1  用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中（注意吸管不要觸及稀釋液），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

7.2.2  另取1 mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。

7.2.3  乳酸菌計數(shù)

7.2.3.1  乳酸菌總數(shù)

根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計，選擇2個～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。

7.2.3.2  雙歧桿菌計數(shù)

    根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計，選擇2個～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50℃的*鋰鹽和半*鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

7.2.3.3  嗜熱鏈球菌計數(shù)

根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計，選擇2個～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后，將冷卻至50℃的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL，轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃需氧培養(yǎng)48 h±2 h，培養(yǎng)后計數(shù)。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為：菌落中等偏小，邊緣整齊光滑的紅色菌落，直徑2 mm±1 mm， 菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

7.2.3.4  乳桿菌計數(shù)

    7.2.3.1 項乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2 項雙歧桿菌與7.2.3.3 項嗜熱鏈球菌計數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計數(shù)。

7.3  菌落計數(shù)

可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

7.3.1  選取菌落數(shù)在30 CFU～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

7.3.2  其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。

7.3.3  當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。

7.4  結(jié)果的表述

7.4.1  若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（mL）中菌落總數(shù)結(jié)果。

7.4.2  若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按公式（1）計算：

式中：

N——樣品中菌落數(shù)；

∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

n1——*稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；

n2——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；

d——稀釋因子（*稀釋度）。

7.4.3  若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對稀釋度zui高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以zui高稀釋倍數(shù)計算。

7.4.4  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

7.4.5  若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計算。

7.4.6  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU～300 CFU之間，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時，則以zui接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

7.5  菌落數(shù)的報告

7.5.1  菌落數(shù)小于100 CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。

7.5.2  菌落數(shù)大于或等于100 CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。

7.5.3  稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

8  結(jié)果與報告

根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果出具報告，報告單位以CFU/g（mL）表示。

9  乳酸菌的鑒定（可選做）

9.1  純培養(yǎng)

挑取3個或以上單個菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，置36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。

9.2  鑒定

9.2.1  雙歧桿菌的鑒定按GB 4789.34的規(guī)定操作。

9.2.2  涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞，革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀，直徑為0.5 μm～2.0 μm，成對或成鏈排列，無芽胞，革蘭氏染色陽性。

9.2.3  乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見表1和表2。

附  錄 A  

培養(yǎng)基及試劑

A.1  MRS培養(yǎng)基

A.1.1  成分

蛋白胨

10.0 g

牛肉粉

5.0 g

酵母粉

4.0 g

葡萄糖

20.0 g

吐溫80

1.0 mL

K2HPO4·7H2O

2.0 g

醋酸鈉·3H2O

5.0 g

檸檬酸三銨

2.0 g

MgSO4·7H2O

0.2 g

MnSO4·4H2O

0.05 g

瓊脂粉

pH 6.2

15.0 g

A.1.2  制法

將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。

A.1.3  *鋰鹽和半*鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基

A.1.3.1  *鋰鹽儲備液制備：稱取50mg*鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。

A.1.3.2  半*鹽酸鹽儲備液制備：稱取250mg*鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中，用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。

A.1.3.2  制法

將A.1.1 成分加入到950 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。臨用時加熱熔化瓊脂，在水浴中冷至48 ℃，用帶有0.22 mm微孔濾膜的注射器將*鋰鹽儲備液及半*鹽酸鹽儲備液制備加入到熔化瓊脂中，使培養(yǎng)基中*鋰鹽的濃度為50 mg/mL，半*鹽酸鹽的濃度為500 mg/mL。

A.2  MC培養(yǎng)基

A.2.1  成分

大豆蛋白胨           

5.0 g

牛肉粉

3.0 g

酵母粉

3.0 g

葡萄糖

20.0 g

乳糖                         

20.0 g

碳酸鈣

10.0 g

瓊脂

15.0 g

蒸餾水

1 000 mL

1％中性紅溶液

pH6.0

5.0 mL

A.2.2  制法

將前面7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH，加入中性紅溶液。分裝后121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。

A.3  乳酸桿菌糖發(fā)酵管

A.3.1  基礎(chǔ)成分

牛肉膏

5.0 g

蛋白胨

5.0 g

酵母浸膏

5.0 g

吐溫80

0.5 mL

瓊脂

1.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸餾水

1 000 mL

A.3.2  制法

按0.5%加入所需糖類，并分裝小試管,121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。

A.4七葉苷培養(yǎng)基

A.4.1 成分

蛋白胨

5.0 g

*

1.0 g

七葉苷

3.0 g

枸櫞酸鐵

0.5 g

1.6%溴甲酚紫酒精溶液

1.4 mL

蒸餾水

100 mL

A.4.2  制法

將上述成分加入蒸餾水中，加熱溶解，121 ℃高壓滅菌15 min～20 min。

A.5革蘭氏染色液

A.5.1  結(jié)晶紫染色液

A.5.1.1  成分

結(jié)晶紫

1.0 g

95％乙醇

20 mL

1％草酸銨水溶液

80 mL

A.5.1.2  制法

將結(jié)晶紫*溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.5.2  革蘭氏碘液

A.5.2.1  成分

碘

1.0 g

*

2.0 g

蒸餾水

300 mL

A.5.2.2  制法

將碘與**行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待*溶解后，再加蒸餾水至300 mL。

A.5.3  沙黃復(fù)染液

A.5.3.1  成分

沙黃

0.25 g

95％乙醇

10 mL

蒸餾水

90 mL

A.5.3.2  制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.5.4  染色法

A.5.4.1 將涂片在酒精燈火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1 min，水洗。

A.5.4.2 滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。

A.5.4.3 滴加95％乙醇脫色，約15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。

A.5.4.4 滴加復(fù)染液，復(fù)染1 min。水洗、待干、鏡檢。