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當(dāng)前位置:上海永葉生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>乳酸菌檢驗(yàn)(征求意見稿)
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的檢驗(yàn)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)。
2 規(guī)范性引用文件
本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是*的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3 術(shù)語和定義
3.1 乳酸菌 lactic acid bacteria
一類可發(fā)酵糖主要產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱。本標(biāo)準(zhǔn)中乳酸菌主要為乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和鏈球菌屬(Streptococcus)。
4 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
4.1 恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃±1 ℃。
4.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。
4.3 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。
4.4 天平:感量0.1 g。
4.5 無菌試管:18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。
4.6 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸頭。
4.7 無菌錐形瓶:500 mL、250 mL。
5 培養(yǎng)基和試劑
5.1 MRS(Man Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基及*鋰鹽(Li-Mupirocin)改良MRS培養(yǎng)基:見附錄A中A.1。
5.2 MC培養(yǎng)基(Modified Chalmers 培養(yǎng)基):見附錄A中A.2。
5.3 0.5%蔗糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.4 0.5%纖維二糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.5 0.5%麥芽糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.6 0.5%*發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.7 0.5%水楊苷發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.8 0.5%*發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.9 0.5%乳糖發(fā)酵管:見附錄A中A.3。
5.10 七葉苷發(fā)酵管:見附錄A中A.4
5.11 革蘭氏染色液:見附錄A中A.5。
5.12 *鋰鹽(Li-Mupirocin):化學(xué)純。
5.13 半*鹽酸鹽(Cysteine Hydrochloride):純度>99%。
6 檢驗(yàn)程序
乳酸菌檢驗(yàn)程序見圖1。
7 操作步驟
7.1樣品制備
7.1.1 樣品的全部制備過程均應(yīng)遵循無菌操作程序。
7.1.2 冷凍樣品可先使其在2 ℃~5 ℃條件下解凍,時間不超過18 h,也可在溫度不超過45 ℃的條件解凍,時間不超過15 min。
7.1.3 固體和半固體食品:以無菌操作稱取25 g樣品,置于裝有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),于8000 r/min~10000 r/min均質(zhì)1 min~2 min,制成1:10樣品勻液;或置于225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min~2 min制成1:10的樣品勻液。
7.1.4 液體樣品:液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無菌吸管吸取樣品25 mL放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,充分振搖,制成1:10的樣品勻液。
7.2 步驟
7.2.1 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL,沿管壁緩慢注于裝有9 mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液。
7.2.2 另取1 mL無菌吸管或微量移液器吸頭,按上述操作順序,做10倍遞增樣品勻液,每遞增稀釋一次,即換用1次1 mL滅菌吸管或吸頭。
7.2.3 乳酸菌計數(shù)
7.2.3.1 乳酸菌總數(shù)
根據(jù)待檢樣品活菌總數(shù)的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至50℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h,培養(yǎng)后計數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15min內(nèi)完成。
7.2.3.2 雙歧桿菌計數(shù)
根據(jù)對待檢樣品雙歧桿菌含量的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至50℃的*鋰鹽和半*鹽酸鹽的MRS培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動平皿使混合均。36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h±2 h,培養(yǎng)后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。
7.2.3.3 嗜熱鏈球菌計數(shù)
根據(jù)待檢樣品嗜熱鏈球菌活菌數(shù)的估計,選擇2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度,每個稀釋度吸取1 mL樣品勻液于滅菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平皿。稀釋液移入平皿后,將冷卻至50℃的MC培養(yǎng)基傾注入平皿約15mL,轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。36℃±1℃需氧培養(yǎng)48 h±2 h,培養(yǎng)后計數(shù)。嗜熱鏈球菌在MC瓊脂平板上的菌落特征為:菌落中等偏小,邊緣整齊光滑的紅色菌落,直徑2 mm±1 mm, 菌落背面為粉紅色。從樣品稀釋到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。
7.2.3.4 乳桿菌計數(shù)
7.2.3.1 項乳酸菌總數(shù)結(jié)果減去7.2.3.2 項雙歧桿菌與7.2.3.3 項嗜熱鏈球菌計數(shù)結(jié)果之和即得乳桿菌計數(shù)。
7.3 菌落計數(shù)
可用肉眼觀察,必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colony-forming units,CFU)表示。
7.3.1 選取菌落數(shù)在30 CFU~300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30 CFU的平板記錄具體菌落數(shù),大于300 CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。
7.3.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數(shù)。
7.3.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時,則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。
7.4 結(jié)果的表述
7.4.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi),計算兩個平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每g(mL)中菌落總數(shù)結(jié)果。
7.4.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時,按公式(1)計算:
式中:
N——樣品中菌落數(shù);
∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和;
n1——*稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個數(shù);
n2——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個數(shù);
d——稀釋因子(*稀釋度)。
7.4.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU,則對稀釋度zui高的平板進(jìn)行計數(shù),其他平板可記錄為多不可計,結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以zui高稀釋倍數(shù)計算。
7.4.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU,則應(yīng)按稀釋度zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
7.4.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計算。
7.4.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30 CFU~300 CFU之間,其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU時,則以zui接近30 CFU或300 CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。
7.5 菌落數(shù)的報告
7.5.1 菌落數(shù)小于100 CFU時,按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報告。
7.5.2 菌落數(shù)大于或等于100 CFU時,第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。
7.5.3 稱重取樣以CFU/g為單位報告,體積取樣以CFU/mL為單位報告。
8 結(jié)果與報告
根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果出具報告,報告單位以CFU/g(mL)表示。
9 乳酸菌的鑒定(可選做)
9.1 純培養(yǎng)
挑取3個或以上單個菌落,嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板,乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板,置36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。
9.2 鑒定
9.2.1 雙歧桿菌的鑒定按GB 4789.34的規(guī)定操作。
9.2.2 涂片鏡檢:乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣,呈長桿狀、彎曲桿狀或短桿狀。無芽胞,革蘭氏染色陽性。嗜熱鏈球菌菌體呈球形或球桿狀,直徑為0.5 μm~2.0 μm,成對或成鏈排列,無芽胞,革蘭氏染色陽性。
9.2.3 乳酸菌菌種主要生化反應(yīng)見表1和表2。
附 錄 A
培養(yǎng)基及試劑
A.1 MRS培養(yǎng)基
A.1.1 成分
蛋白胨
10.0 g
牛肉粉
5.0 g
酵母粉
4.0 g
葡萄糖
20.0 g
吐溫80
1.0 mL
K2HPO4·7H2O
2.0 g
醋酸鈉·3H2O
5.0 g
檸檬酸三銨
2.0 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
MnSO4·4H2O
0.05 g
瓊脂粉
pH 6.2
15.0 g
A.1.2 制法
將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH,分裝后121 ℃高壓滅菌15 min~20 min。
A.1.3 *鋰鹽和半*鹽酸鹽改良MRS培養(yǎng)基
A.1.3.1 *鋰鹽儲備液制備:稱取50mg*鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中,用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。
A.1.3.2 半*鹽酸鹽儲備液制備:稱取250mg*鋰鹽加入到50 mL蒸餾水中,用0.22 mm微孔濾膜過濾除菌。
A.1.3.2 制法
將A.1.1 成分加入到950 mL蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH,分裝后121 ℃高壓滅菌15 min~20 min。臨用時加熱熔化瓊脂,在水浴中冷至48 ℃,用帶有0.22 mm微孔濾膜的注射器將*鋰鹽儲備液及半*鹽酸鹽儲備液制備加入到熔化瓊脂中,使培養(yǎng)基中*鋰鹽的濃度為50 mg/mL,半*鹽酸鹽的濃度為500 mg/mL。
A.2 MC培養(yǎng)基
A.2.1 成分
大豆蛋白胨
5.0 g
牛肉粉
3.0 g
酵母粉
3.0 g
葡萄糖
20.0 g
乳糖
20.0 g
碳酸鈣
10.0 g
瓊脂
15.0 g
蒸餾水
1 000 mL
1%中性紅溶液
pH6.0
5.0 mL
A.2.2 制法
將前面7種成分加入蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH,加入中性紅溶液。分裝后121 ℃高壓滅菌15 min~20 min。
A.3 乳酸桿菌糖發(fā)酵管
A.3.1 基礎(chǔ)成分
牛肉膏
5.0 g
蛋白胨
5.0 g
酵母浸膏
5.0 g
吐溫80
0.5 mL
瓊脂
1.5 g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
1.4 mL
蒸餾水
1 000 mL
A.3.2 制法
按0.5%加入所需糖類,并分裝小試管,121 ℃高壓滅菌15 min~20 min。
A.4七葉苷培養(yǎng)基
A.4.1 成分
蛋白胨
5.0 g
*
1.0 g
七葉苷
3.0 g
枸櫞酸鐵
0.5 g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液
1.4 mL
蒸餾水
100 mL
A.4.2 制法
將上述成分加入蒸餾水中,加熱溶解,121 ℃高壓滅菌15 min~20 min。
A.5革蘭氏染色液
A.5.1 結(jié)晶紫染色液
A.5.1.1 成分
結(jié)晶紫
1.0 g
95%乙醇
20 mL
1%草酸銨水溶液
80 mL
A.5.1.2 制法
將結(jié)晶紫*溶解于乙醇中,然后與草酸銨溶液混合。
A.5.2 革蘭氏碘液
A.5.2.1 成分
碘
1.0 g
*
2.0 g
蒸餾水
300 mL
A.5.2.2 制法
將碘與**行混合,加入蒸餾水少許充分振搖,待*溶解后,再加蒸餾水至300 mL。
A.5.3 沙黃復(fù)染液
A.5.3.1 成分
沙黃
0.25 g
95%乙醇
10 mL
蒸餾水
90 mL
A.5.3.2 制法
將沙黃溶解于乙醇中,然后用蒸餾水稀釋。
A.5.4 染色法
A.5.4.1 將涂片在酒精燈火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染色液,染1 min,水洗。
A.5.4.2 滴加革蘭氏碘液,作用1 min,水洗。
A.5.4.3 滴加95%乙醇脫色,約15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗。
A.5.4.4 滴加復(fù)染液,復(fù)染1 min。水洗、待干、鏡檢。
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