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更新時(shí)間：2018-06-19 16:00:59瀏覽次數(shù)：709次
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Tfl DNA聚合酶Tfl DNA Polymerase （Tfl DNA 聚合酶） 是從黃色棲熱菌（Thermus flavus ） 中提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94kDa。這種酶可在74℃復(fù)制 DNA，在95℃的半衰期為40 分鐘。Tfl DNA 聚合酶在鎂離子存在的條件下可催化核苷酸沿5` → 3` 方向發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA；也可在鎂離子存在條件下以RNA 為模板沿5` → 3`
Tfl DNA聚合酶
名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 手冊(cè) |
Tfl DNA聚合酶 | 100 U | 390元 |
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Tfl DNA Polymerase (Tfl DNA 聚合酶) 是從黃色棲熱菌(Thermus flavus ) 中提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約為94kDa。這種酶可在74℃復(fù)制 DNA，在95℃的半衰期為40 分鐘。Tfl DNA 聚合酶在鎂離子存在的條件下可催化核苷酸沿5` → 3` 方向發(fā)生聚合反應(yīng)，形成雙鏈DNA；也可在鎂離子存在條件下以RNA 為模板沿5` → 3`方向合成DNA。該酶具有5` → 3` 外切酶活力。當(dāng)使用Tfl DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 反應(yīng)和引物延伸反應(yīng)時(shí)，推薦在較高溫度條件下進(jìn)行。本產(chǎn)品隨酶提供的10× 反應(yīng)緩沖液中不含有Mg2+。單獨(dú)提供足量的25mM MgSO4 溶液以便于在不同條件下優(yōu)化酶反應(yīng)。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層(無(wú)色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
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