酪蛋白被認(rèn)為是廣譜danbaimei的通用底物。作為天然酪蛋白，這種熒光素酪蛋白被許多danbaimei水解，并廣泛用于熒光檢測(cè)danbaimei活性。在完整的底物中，酪蛋白被5-FITC大量標(biāo)記，導(dǎo)致明顯的熒光猝滅。danbaimei催化的水解減輕了其猝滅作用，產(chǎn)生了鮮綠色熒光染料標(biāo)記的短肽。熒光強(qiáng)度的增加與danbaimei活性成正比。我們不建議將該綴合物用于熒光偏振測(cè)定。對(duì)于熒光偏振，我們可以定制制作輕度標(biāo)記的熒光素酪蛋白偶聯(lián)物。

酪蛋白的化學(xué)性質(zhì)
外觀：淺黃色粉末
激發(fā)/發(fā)射：494/521 nm
溶劑：水

儲(chǔ)備溶液的制備

除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，制備后應(yīng)儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

酪蛋白，F(xiàn)ITC結(jié)合的原液：
在PBS緩沖液中制成5-10 mg / mL酪蛋白，F(xiàn)ITC結(jié)合的原液。

準(zhǔn)備工作溶液

酪蛋白FITC偶聯(lián)的工作溶液（2X）：
將FITC偶聯(lián)的原液稀釋至100-400μg/ mL的50-100 mM Tris緩沖液（pH 7.4）。2X Assay工作溶液設(shè)計(jì)用于檢測(cè)yiningrudanbaimei，yidanbaimei，嗜熱菌蛋白酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV和人白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性。對(duì)于其他蛋白酶，請(qǐng)參考表1中合適的測(cè)定緩沖液配方。對(duì)于每種蛋白酶，應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定測(cè)定工作溶液的*濃度。

程序

1. 將等體積的yidanbaimei標(biāo)準(zhǔn)品或樣品與2X Assay工作溶液混合。
   

2. 在Ex / Em = 490/525 nm處監(jiān)測(cè)熒光的增加。
   
   一種。對(duì)于動(dòng)力學(xué)讀數(shù)：立即開(kāi)始連續(xù)連續(xù)測(cè)量熒光強(qiáng)度，并每5分鐘記錄一次數(shù)據(jù)，持續(xù)30分鐘。
   
   b。對(duì)于終點(diǎn)讀數(shù)：在避光的條件下，將反應(yīng)在所需溫度下孵育30至60分鐘。然后測(cè)量熒光強(qiáng)度。

表1.測(cè)定工作溶液的適當(dāng)測(cè)定緩沖液配方。