Cy3酪胺（Cy3 tyramide），是一種用于熒光信號(hào)放大的探針，通過(guò)HRP和過(guò)氧化氫催化，標(biāo)記到抗體上。經(jīng)常有小伙伴問(wèn)小螢Cy3酪胺的實(shí)驗(yàn)方案，那么，教程來(lái)啦，小螢手把手教您做實(shí)驗(yàn)！

一.百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)適用范圍

Cy3 酪胺（Cy3 tyramide）是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的Cy系列產(chǎn)品，該產(chǎn)品適合標(biāo)記抗體或蛋白,應(yīng)用于細(xì)胞或組織。

二.百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)優(yōu)勢(shì)

1.檢測(cè)靈敏度高；

2.熒光信號(hào)增強(qiáng)；

3.減少非特異性背景信號(hào)；

4.可以使用標(biāo)準(zhǔn)Cy3過(guò)濾器組輕松檢測(cè)。

三．百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)適用儀器

熒光顯微鏡

Ex:	Cy3/TRITC濾波片
Em:	Cy3/TRITC濾波片
推薦孔板：	黑色透明底板
濾波片：	Cy3/TRITC濾波片

Ex:

四．百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)實(shí)驗(yàn)方案

樣品染色示例

概述

1.固定/透化/阻斷細(xì)胞或組織

2.在封閉緩沖液中加入一抗

3.加入HRP標(biāo)記的二抗

4.準(zhǔn)備酪胺工作溶液，室溫下將其用于細(xì)胞或組織中5-10分鐘

溶液配置

儲(chǔ)備溶液配置

在沒(méi)有額外說(shuō)明的情況下，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融

制備儲(chǔ)備溶液（1000x）

加入適量的DMSO，制成1-5mM的酪胺儲(chǔ)備液。

注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下儲(chǔ)存

工作溶液配置

酪胺工作溶液（1X）

將1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的緩沖液中。

注意：1.Tris Buffer，pH = 7.4合適。

2. Tyramide工作溶液即用即配。

實(shí)驗(yàn)方案

（本方案適用于細(xì)胞核組織染色）

細(xì)胞固定和透化

1. 在室溫下，用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定細(xì)胞或組織20分鐘。

2. 2.用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。

3.在室溫下，用0.1％Triton X-100溶液使細(xì)胞透化1-5分鐘。

4.用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。

注意：組織固定，脫蠟和再水化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)IHC方案對(duì)組織進(jìn)行脫蠟和脫水。根據(jù)需要，使用優(yōu)選的特定溶液/方案進(jìn)行抗原修復(fù)。

過(guò)氧化物酶標(biāo)記

1.可選：將細(xì)胞或組織樣本置于過(guò)氧化物酶淬滅液（如3%過(guò)氧化氫）中孵育10分鐘，以淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后在室溫下，用PBS沖洗兩次。

2.用封閉溶液（如含有1％BSA的PBS）在4℃下封閉30分鐘。

3.取出封閉溶液，加入稀釋好的一抗，在室溫下孵育60分鐘或在4°C下孵育過(guò)夜。

4.用PBS洗滌三次，每次5分鐘。

5.向每個(gè)樣品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室溫下孵育60分鐘。

注意：孵育時(shí)間和濃度可根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度而變化。

6.用PBS洗滌三次，每次5分鐘。

酪胺標(biāo)記

1.準(zhǔn)備100μL 酪胺工作溶液，將其應(yīng)用于每個(gè)樣品，并在室溫下孵育5-10分鐘。

注意：如果您觀察到非特異性信號(hào)，可以縮短酪胺的孵育時(shí)間。您應(yīng)使用不同孵育時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本，以優(yōu)化孵育期。或者您可以在工作溶液中使用較低濃度的酪胺。

2.用PBS沖洗三次

復(fù)染和熒光成像

1.根據(jù)需要，對(duì)細(xì)胞或組織樣本復(fù)染。 AAT提供了一系列細(xì)胞核復(fù)染試劑，如表1所列。按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.加上蓋玻片。

3.使用適當(dāng)?shù)臑V波器觀察酪胺標(biāo)記的信號(hào)。

表1.推薦用于核復(fù)染的產(chǎn)品

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百螢課堂之Cy3酪胺的實(shí)驗(yàn)方案

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