Amplite 過氧化物和酶近紅外熒光底物是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測過氧化氫的熒光探針，我們的Amplite IR是一種熒光性過氧化酶底物，與過氧化酶和H2O2反應(yīng)時，產(chǎn)生近紅外熒光。它可以用來檢測H2O2和過氧化酶。Amplite IR產(chǎn)生的物質(zhì)在647nm處具有大吸收峰，同時在647nm處有大發(fā)射峰。這種近紅外吸收和熒光將檢測的本底降至小，這些本底經(jīng)常由自我吸收和/或生物樣品自身的熒光，但是在600nm附近自身光吸收基本沒有。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 過氧化物和酶近紅外熒光底物 。

實驗方案

樣品實驗方案

簡要概述

1.制備100μMAmplite IR 0.8 U / ml的過氧化物酶在磷酸鹽緩沖液，并在孔中加入50微升

2.添加H 2 O 2標準品或測試樣品（50μL）

3.在室溫下孵育0-30分鐘

4.監(jiān)測Ex / Em = 640 / 680nm處的熒光強度

溶液制備

1.儲備溶液

所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1.1Amplite IR原液：
加入適量無水DMSO，制成10至25 mM Amplite IR原液。

2.工作溶液

Amplite IR工作溶液（2X）：
為了在50 mM磷酸鹽緩沖液或您選擇的緩沖液中達到每孔50至100μM的終濃度，在管中制備100至200μM濃度的溶液。每孔需要50μL。 注意：在硫醇如DTT和b-巰基乙醇存在下，Amplite IR不穩(wěn)定。高于10μM（終濃度）的硫醇可顯著降低測定動態(tài)范圍。NADH和谷*甘肽（從GSH中還原）可能會干擾測定。注意：我們建議您每次進行實驗時都使用新鮮原液。

操作步驟

1.在上清液中進行H2O2測定

1.1將50μL的2X Amplite IR工作溶液（來自步驟1.2）添加到H 2 O 2標準品，空白對照和測試樣品的每個孔中，以使總H2O2測定體積為100μL/孔。注意：對于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μL2XAmplite IR工作溶液。

1.2在室溫下孵育反應(yīng)0至30分鐘，避光。

1.3使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 640 / 680nm處的熒光增加。 注意：Amplite IR過氧化物酶底物易于自氧化，因此一旦加入H2O2反應(yīng)混合物就讀取熒光，以提高信噪比。

1.4空白孔中的熒光（僅使用測定緩沖液）用作對照，并從具有H2O2的那些孔的值中減去。

2.運行H2O2測定法的細胞：

2.1Amplite IR可用于測量細胞中H2O2的釋放。以下是建議的方案，可根據(jù)您的具體研究需要進行修改.Dipite IR工作溶液應(yīng)按步驟1.2制備，但磷酸鹽緩沖液應(yīng)替換為細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使用的培養(yǎng)基。建議的培養(yǎng)基包括（a）Krebs Ringers磷酸鹽緩沖液（KRPB）; （b）中。漢克斯平*鹽溶液（HBSS）; 或（c）無血清培養(yǎng)基。

2.2在96孔板（50-100μL/孔）中制備細胞，并根據(jù)需要細胞。 注意：包括陰性對照（單獨培養(yǎng)基和非活化細胞）用于測量背景熒光。

2.3加入50微升H2O2反應(yīng)混合物至細胞的每個孔中，注意：對于384孔板中，添加25μL細胞和25微升H2O2反應(yīng)混合物倒入每個孔。

2.4在室溫下孵育反應(yīng)0至30分鐘，避光。

2.5使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 640 / 680nm處的熒光增加。 注意：也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，并用吸光度酶標儀在670nm波長下讀數(shù)。與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。 注意：熒光背景隨時間增加，因此減去每個數(shù)據(jù)點的空白孔的熒光強度值是很重要的。