Amplite NADPH檢測(cè)試劑盒(比色法) 是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NADPH的試劑盒，煙X胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙X胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定基于監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化。 NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定的短紫外波長使得傳統(tǒng)方法具有低靈敏度和高干擾。 AAT Bioquest的Amplite 比色NADPH檢測(cè)試劑盒為檢測(cè)NADPH提供了一種便捷的方法。 NADPH探針是一種生色傳感器，在NADPH減少時(shí)具有460nm的大吸光度。 NADPH探針的吸收與溶液中NADPH的濃度成正比。 Amplite 比色NADPH檢測(cè)試劑盒提供靈敏的檢測(cè)方法，可在100μL檢測(cè)體積中檢測(cè)低至3μM的NADPH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NADPH檢測(cè)試劑盒(比色法) 。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板檢測(cè)示例

概述

準(zhǔn)備NADPH反應(yīng)混合物（50μL）

加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品（50μL）

在室溫孵育或15分鐘至2小時(shí)

孵育460 nm處的監(jiān)測(cè)吸光度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。

操作步驟

1.準(zhǔn)備NADPH原液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中以制備1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NADPH反應(yīng)混合物：

將1mL NADPH探針（組分A）加入4mL NADPH測(cè)定緩沖液（組分B）中，并充分混合。

注意：5mL NADPH反應(yīng)混合物用于一個(gè)96孔。 未使用的NADPH反應(yīng)混合物應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋液（0至100μM）：

3.1將100μLNADPH儲(chǔ)備溶液（來自步驟1）加入400μLPBS緩沖液（pH 7.4）中，以產(chǎn)生200μM（100pmol / L）NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL的200μMNADPH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，得到NADPH標(biāo)準(zhǔn)品的100,50,25,12.5,6.25,3.13和0μM連續(xù)稀釋液。

如表1和2中所述，將NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NADPH的測(cè)試樣品的系列稀釋液加入白色/透明底96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要制備細(xì)胞或組織樣品。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞（詳見附錄）。

表1在白色/透明底96孔微孔板中的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意：NS = NADPH標(biāo)準(zhǔn)，BL =空白對(duì)照，TS =測(cè)試樣品

表2每個(gè)孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADPH標(biāo)準(zhǔn)品（3.13μM至200μM）加入NS1至NS7的孔中，一式兩份

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NADPH測(cè)定：

4.1將50μLNADPH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADPH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品的每個(gè)孔中（參見步驟3.3），使總NADPH測(cè)定體積為100μL/孔

注1：對(duì)于384孔板，每孔加入25μL樣品和25μLNADPH反應(yīng)混合物。

注2：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 為方便起見，裂解緩沖液（組分D）可用于裂解細(xì)胞（詳見附錄）。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用吸光度讀板儀在460 nm處檢測(cè)吸光度的增加。