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上海一基實(shí)業(yè)有限公司

血清,蛋白,培養(yǎng)基,生物試劑,清洗機(jī)

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公司動(dòng)態(tài)

植物丙酮酸脫氫酶激酶總活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

點(diǎn)擊次數(shù):243 發(fā)布時(shí)間:2016-6-28

YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase活性光度法定量

檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(中文版)

主要用途

YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)特異反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型*腺嘌呤二核苷酸NAD)還原后峰值的增高即采用光度法來(lái)測(cè)定植物組織裂解樣品中酶活性而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種植物組織,包括種子(seed)、葉片(leaf)、根(root)、胚胎葉(cotyledon)、上胚軸(epicotyl)等丙酮酸脫氫酶激酶活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

丙酮酸脫氫酶激酶(pyruvate dehydrogenase kinase;PDK;EC2.7.11.2或EC2.7.1.99),又稱為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物激酶(pyruvate dehydrogenase complex kinase),屬于*/*激酶家族成員之一,位于線粒體基質(zhì)內(nèi)。其功能在于調(diào)節(jié)碳水化合物代謝,控制PDH活化狀態(tài),通過(guò)可逆性磷酸化丙酮酸脫氫酶(E1)α亞體上的*殘基,以達(dá)到ATP依賴性丙酮酸脫氫酶失活,降低丙酮酸氧化,增強(qiáng)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。PDK短期調(diào)節(jié)是由糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸以及ADP等抑制其活性,而線粒體內(nèi)乙酰*和NADH水平增高激活其活性。哺乳動(dòng)物丙酮酸脫氫酶激酶分為4個(gè)同工酶,而植物有1至2個(gè)同工酶:玉米和水稻有2種,擬南芥有1種。其中植物PDK1主要位于葉部,在植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中高達(dá)表達(dá),而PDK2存在于所有組織器官,與光合作用有關(guān)。通過(guò)抑制PDK活性,可以改變植物生長(zhǎng)表型,提高生長(zhǎng)產(chǎn)率(包括種子重量或含油量增加),花期提前,周期縮短。植物同工酶具有70至77%的同源性,而與哺乳動(dòng)物只有37%同源性,其結(jié)構(gòu)與原核生物*激酶(histidine kinase)相同。 基于底物丙酮酸脫氫酶pyruvate dehydrogenase;PDH),在ATP存在與否的情況下,受到丙酮酸脫氫酶激酶磷酸化后,其輔酶因子氧化型*腺嘌呤二核苷酸oxidized nicotinamide adenine dinucleotide;β-NAD)轉(zhuǎn)化為還原型*腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;β-NADH產(chǎn)生變化,通過(guò)測(cè)定吸光值(340nm 波長(zhǎng)),來(lái)定量分析丙酮酸脫氫酶激酶活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為:

                              

產(chǎn)品內(nèi)容

 

YIJI清理液(Reagent A)  毫升

YIJI裂解液(Reagent B)  毫升

YIJI緩沖液(Reagent C)  毫升

YIJI反應(yīng)液(Reagent D)       毫升

YIJI底物液(Reagent E)       毫升

YIJI陰性液(Reagent F)    毫升

YIJI專性液(Reagent G)            微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

 

保存方式

 

保存YIJI裂解液(Reagent B)、YIJI緩沖液(Reagent C)、YIJI反應(yīng)液(Reagent D)、YIJI底物液(Reagent E)YIJI專性液(Reagent G)在-20冰箱里;其余的保存在4冰箱里;YIJI反應(yīng)液(Reagent D)和YIJI底物液(Reagent E)避免光照;有效保證6

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器:用于組織勻化

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板:用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀:用于光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的YIJI裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 樣品準(zhǔn)備

 

  • 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等),并秤重以確定1克組織重量 
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升YIJI清理液(Reagent A清洗1
  • 即刻用刀片切碎組織
  • 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的xx毫升YIJI裂解液(Reagent B)
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器,在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80下)
  • 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管,放進(jìn)4微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移出上清液(注意:不要觸碰沉淀物)到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)如果上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?,重?fù)離心5分鐘一次,速度5000g(或7500RPM,例如eppendorf 5415)
  • 即刻移入到1.5毫升離心管
  • 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)(注意:建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-YJ30030.1
  • 放進(jìn)-70的冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

  • 測(cè)定準(zhǔn)備

 

  • 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為30℃):波長(zhǎng)340nm,間隔60秒,讀數(shù)6次(共5分鐘),并置零 
  • 從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;YIJI底物液(Reagent E避免光照
  • YIJI緩沖液(Reagent C在室溫下均衡溫度

 

  • 背景對(duì)照測(cè)定

 

  • 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent E
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入xx微升YIJI陰性液(Reagent F
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為背景空對(duì)照(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))

 

  • 樣品總活性測(cè)定

 

  • 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent E
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻
  • 30℃溫度下孵育3分鐘
  • 加入5微升待測(cè)樣品(100微克蛋白)(注意:樣品須清澈
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品讀數(shù)5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù)) 

 

  • 樣品非特異活性測(cè)定

 

  • 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI專性液(Reagent G
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent E
  • 放進(jìn)30培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
  • 加入5微升待測(cè)樣品100微克蛋白)(注意:樣品須清澈
  • 上下傾倒數(shù)次,混勻(限定在3秒之內(nèi))
  • 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè),此為樣品非特異活性讀數(shù)5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))

 

  • 計(jì)算樣品活性

 

1)樣品活性(總活性非特異活性)

 

 

2)樣品特異活性

 

 

  • 酶標(biāo)儀測(cè)定

 

1)樣品總活性測(cè)定

  • 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:背景對(duì)照和樣品總活性
  • 分別移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C到96孔板
  • 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液(Reagent D
  • 分別加入xx微升YIJI底物液(Reagent E
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 在30溫度下孵育3分鐘
  • 分別加入xx微升YIJI陰性液(Reagent F待測(cè)樣品100微克蛋白)到相應(yīng)孔(注意:樣品須清澈
  • 輕輕搖動(dòng)96孔
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

 

2)樣品非特異活性測(cè)定

  • 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:待測(cè)樣品
  • 移取xx微升YIJI緩沖液(Reagent C到96孔板
  • 加入xx微升YIJI反應(yīng)液(Reagent D
  • 加入xx微升YIJI專性液(Reagent G
  • 加入xx微升YIJI底物液(Reagent E 
  • 輕輕搖動(dòng)96孔板
  • 在30溫度下孵育3分鐘
  • 加入5微升待測(cè)樣品(注意:100微克蛋白)
  • 輕輕搖動(dòng)96孔
  • 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè):0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

 

  • 樣品特異活性計(jì)算

 

(1)樣品活性(總活性非特異活性)

 

 

(2)樣品特異活性

 

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為20次操作,包括背景對(duì)照
  • 操作時(shí),須戴手套
  • 系統(tǒng)操作過(guò)程中,背景測(cè)定只需1
  • 建議使用比色皿測(cè)定
  • 樣品須澄清,至關(guān)重要 
  • 加樣后3秒內(nèi)光度測(cè)定
  • 測(cè)定值由低到高變化;測(cè)定可持續(xù)5分鐘
  • 光度測(cè)定后,比色皿須清洗*
  • 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
  • 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/5微升;如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高,則可以增加或降低樣本量(本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-YJ30030.1)
  • 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調(diào)整樣品濃度
  • 丙酮酸脫氫酶激酶單位活性定義為:在30℃,pH 7.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠抑制轉(zhuǎn)化1微摩爾丙酮酸乙酰*所需的酶量作為一個(gè)活性單位
  • 本公司提供系列丙酮酸脫氫酶通路分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

 

 

訂購(gòu)信息

 

單組分訂購(gòu)信息

 

編號(hào) 名稱 規(guī)格

YJ50777.4 YIJI植物丙酮酸脫氫酶激酶總活性光度法定量檢測(cè)試劑盒 20

YJ50777.4A YIJI清理液(Reagent A     毫升

YJ50777.4B YIJI裂解液(Reagent B      毫升

YJ50777.4C YIJI緩沖液(Reagent C     毫升

YJ50777.4D YIJI底物液Reagent D      毫升

YJ50777.4E YIJI反應(yīng)液(Reagent E      毫升

YJ50777.4F YIJI陰性液(Reagent F 毫升

YJ50777.4G  YIJI性液(Reagent G 毫升

 

試劑盒訂購(gòu)信息

 

產(chǎn)品編號(hào)

名稱

規(guī)格

YJ50777.1

細(xì)胞丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase活性光度法定量檢測(cè)試劑盒

20次

YJ50777.4

組織丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase活性光度法定量檢測(cè)試劑盒

20次

YJ50777.3

純化線粒體丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase活性光度法定量檢測(cè)試劑盒

20次

YJ50777.4

植物丙酮酸脫氫酶激酶pyruvate dehydrogenase kinase)活性光度法定量檢測(cè)試劑盒

20次

 

 

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