本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的孔雀石綠結(jié)晶紫和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結(jié)晶紫的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較可得出相應(yīng)孔雀石綠結(jié)晶紫的含量。
(1) 2-8 ℃保存，
切勿冷凍?！?/div>
(2) 將不用的酶標板放進原袋中重新密封。
(3) 酶標記物和顯色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
(1) 魚/蝦樣品的準備(稀釋倍數(shù)10)
先將魚肉勻質(zhì)后，稱取0.5 g樣品，加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸緩沖液，200ul的0.25g/mL鹽酸羥胺，300ul的0.05mol/L對甲苯磺酸，震蕩15分鐘使之成勻漿，12000rpm離心5min，然后取上清用PBST稀釋5倍，用作ELISA檢測
(2) 水質(zhì)樣品(稀釋倍數(shù)1)離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時試劑的準備
(1)注意事項
A)使用之前將所有試劑平衡至室溫。
B)使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
C)在使用中不要讓微孔干燥。
D)EIA分析的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的*性，仔細按照*的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點。
E)在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
(2)濃縮洗滌液使用前應(yīng)根據(jù)所需量進行20倍稀釋，即按1mL濃縮洗滌液加入19mL蒸餾水的比例進行稀釋。
8. 標準樣品配制方法：
(1)用稀釋好的洗液將1mg/mL的標準品液稀釋1000倍，變成1000ng/mL，振蕩混勻。
(2)準備5個1 mL瓶子，其中一個加入1000 μL洗液，其余的分別加入600 μL洗液。
(3)在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液，然后加入4.05 μL的1000 ng/mL標準品，
混勻，使其濃度為4.05 ng/mL，作好記號；
(4)再從4.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為1.35 ng/mL，混勻，作好記號；
(5)再從1.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.45 ng/mL，混勻，作好記號；
(6)再從0.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.15 ng/mL，混勻，作好記號；
(7)再從0.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中，使其濃度為0.05 ng/mL，混勻，作好記號。
9. 測定程序
(1)將標準品、樣品所需微量反應(yīng)板(均需2個平行試驗)放在反應(yīng)架上。
(2)加入50μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
(3)加入50μl已稀釋的抗體應(yīng)用液加入微量反應(yīng)板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)20分鐘。
(4)棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
(5)加入100μl酶標記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應(yīng)15分鐘。
(6)棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。
(7)加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。
(8)加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。
10. 結(jié)果
以標準品百分吸光率為縱坐標，以孔雀石綠標準品濃度(ng/mL)的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。
11. 測定技術(shù)指標
(1) 靈敏度：
孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.01ng/g(0.01ppb)。
(2) 準確度(回收率)：回收率為90%±15%。
12. 交叉反應(yīng)活性
孔雀石綠檢測試劑盒能檢測孔雀石綠及其相似物，它們的結(jié)合程度不同。以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率(%CR)，所有濃度均為ppb級。
| 種類 | % CR |
| 孔雀石綠 | * |
| 隱性孔雀石綠 | <10% |
| 結(jié)晶紫 | * |
| 隱性結(jié)晶紫 | <10% |
