絲裂原活化蛋白激酶1抗體

SDS-PAGE電泳
① 將抗原（細(xì)胞裂解液、重組蛋白）樣品置于凝膠加樣緩沖液中，在100℃加熱三分鐘以使蛋白質(zhì)變性。
② 設(shè)計(jì)加樣順序，作好實(shí)驗(yàn)記錄，按預(yù)定順序加樣。一般每個(gè)電泳道加樣zui大體積為25µl,每個(gè)電泳道上樣的zui低蛋白質(zhì)量（每一條蛋白質(zhì)條帶）：0.1µg（考馬斯亮藍(lán)染色）-2ng（銀染色）,zui高蛋白質(zhì)量（蛋白質(zhì)混合物）：20-40µg。
③ 把電泳裝置與電源連接好，將電壓調(diào)至200V，電流應(yīng)流向陽(yáng)極，待溴酚藍(lán)遷移到分離膠底部0.5cm處，關(guān)閉電源。
④ 從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用去離子水沖洗干凈。準(zhǔn)備進(jìn)行免疫印操作。

免疫印跡操作-轉(zhuǎn)膜
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡15-20min.
② 帶上手套，裁剪好濾紙（Whatman,3MM CHR）和NC膜，濾紙和膜大小為83mm×75mm，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。
③ 打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒并放置淺盤中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊*浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的Whatman,3MM濾紙。
④ 小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡（用轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕并戴手套以轉(zhuǎn)移緩沖液潤(rùn)濕膠面，小心將NC膜放在膠面上，從凝膠的一邊開(kāi)始輕輕放下可避免氣泡，注意一定要戴手套或鑷子接觸膜）。
⑤用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移槽。
⑥將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。
⑦將整個(gè)裝置放在磁力攪拌器上并開(kāi)始攪拌，連接好轉(zhuǎn)移電極恒壓100V轉(zhuǎn)移90min，若轉(zhuǎn)移過(guò)夜則恒壓30V。
⑧電轉(zhuǎn)完畢后，將NC膜置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時(shí)或4℃過(guò)夜。

免疫檢測(cè)  絲裂原活化蛋白激酶1抗體 
一抗與靶蛋白的結(jié)合
① 封閉的膜用PBST漂洗2-3次。
② 將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤(rùn)洗，晾干，將膜用一次性手套覆蓋好，按標(biāo)記和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)切下膜條（一般為3 mm寬左右）按順序置于加樣槽中，作好實(shí)驗(yàn)記錄，加入相應(yīng)的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
③ 室溫下于搖床孵育2h或4℃過(guò)夜。
④ 棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復(fù)4次。
  酶標(biāo)記二抗與一抗的結(jié)合
① 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要和設(shè)計(jì)選擇合適的酶標(biāo)二抗和稀釋濃度（用含0.5%脫脂奶粉的PBS稀釋），每個(gè)加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4℃過(guò)夜，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個(gè)槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復(fù)4次。

顯色反應(yīng)（注：二抗一般有兩種常用標(biāo)記酶，HRP和AP，其相對(duì)應(yīng)的顯色底物試劑盒為DAB和BCIP/NBT）
① HRP標(biāo)記二抗顯色
   用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）顯色，按順序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻，將膜加入顯色液中避光顯色15 min左右終止反應(yīng)，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標(biāo)記二抗顯色
   用AKP緩沖液洗膜5min，棄去AP緩沖液，加入顯色液（66µlNBT溶液同10mlAKP緩沖液充分混合均勻后加入33µl BCIP溶液1h內(nèi)使用），室溫下顯色（37℃可加速反應(yīng)），顯色反應(yīng)通常在30min內(nèi)可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜終止反應(yīng),記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾干掃描保存。反應(yīng)溶液可預(yù)先配置，可在4℃儲(chǔ)存一年以上。