埃茲蛋白抗體相關(guān)信息

Western bloting要注意的一些問(wèn)題
1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說(shuō)服力都要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照分為：陽(yáng)性對(duì)照（有標(biāo)準(zhǔn)品（比如β-actin，GAPDH）或陽(yáng)性血清）；陰性對(duì)照（測(cè)血時(shí)用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對(duì)照（不加一抗，用PBS代替）；無(wú)關(guān)對(duì)照（用無(wú)關(guān)抗體）
2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說(shuō)明書(shū)選擇zui適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景的深淺。
3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來(lái)個(gè)體差異。特別在做裂解液時(shí)更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不確定性。
4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒(méi)有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過(guò)多，太多會(huì)導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。
5、電泳、轉(zhuǎn)膜時(shí)特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過(guò)高；轉(zhuǎn)膜時(shí)“三明治”的疊放次序不錯(cuò)，同時(shí)要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。
6、封閉時(shí)一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是*標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻?，用BSA效果更好。
7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。
8、在顯色發(fā)光時(shí)要特別注意二抗所對(duì)應(yīng)的顯色方法，特別是在發(fā)光時(shí)要注意發(fā)光時(shí)間和顯影時(shí)間的控制，以看得清楚目的條帶為標(biāo)準(zhǔn)。
埃茲蛋白抗體相關(guān)信息 
四、Western bloting在抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用
     Western bloting是用來(lái)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的一種常用方法，通過(guò)抗原抗體的免疫反應(yīng)可以定量測(cè)出抗體的相對(duì)分子量，以及抗體的相對(duì)豐度或與已知抗原的關(guān)系等等。目前它應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域,在臨床上檢測(cè)傳染病和自身免疫病、過(guò)敏癥等，在抗體生產(chǎn)領(lǐng)域它與ELISA、ICC、IHC、IFA等免疫技術(shù)相接合已成為單克隆抗體生產(chǎn)的主要篩選手段。
     在單抗的篩選過(guò)程中通常釆用幾中免疫技術(shù)并存的方式進(jìn)行篩選，針對(duì)不同的抗體釆用不同的技術(shù)，有利于提搞抗體生產(chǎn)的篩選效率，下面就針對(duì)幾種常用的方法與Western blot進(jìn)行比較：
方法        ELISA        WB        IHC/ICC        免疫熒光（IFA）
操作        簡(jiǎn)單，周期短        復(fù)雜，周期長(zhǎng)        較簡(jiǎn)單        較簡(jiǎn)單（要專(zhuān)門(mén)的熒光顯微鏡）
靈敏度        高，易產(chǎn)生假陽(yáng)性        高，特異性高        較WB低        較ICC高
交叉        有.        有，易識(shí)別（根據(jù)抗原分子的大?。?/span>        有，難識(shí)別        有
準(zhǔn)確度        定性        定性定分子量        定位        定位
載體        酶標(biāo)板        凝膠、膜        玻片        玻片
結(jié)果        普通顯色        化學(xué)化光/普通顯色        普通顯色        熒光
在抗體檢測(cè)中Western bloting經(jīng)常要注意到目標(biāo)抗體與抗原（細(xì)胞/組織裂解液）的接合能力，特別是交叉現(xiàn)象，所以一定要設(shè)置好對(duì)照實(shí)驗(yàn)。同時(shí)還有測(cè)血、測(cè)母克隆亞克隆過(guò)程中一定要注意抗體的稀釋倍數(shù)以及二抗的使用等等。
總而言之，做Wetern bloting實(shí)驗(yàn)熟練撐握原理和操作是前提，關(guān)鍵是統(tǒng)籌整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，合理安排，注意細(xì)節(jié)，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)的性和準(zhǔn)確性。