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利用密度梯度方法進(jìn)行核糖體分離
點(diǎn)擊次數(shù):6243 發(fā)布時(shí)間:2012-10-8
核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所,也是細(xì)胞中含量zui多的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體,在真核生物中數(shù)目龐大。核糖體除參與蛋白質(zhì)合成外,還與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞壽命、胚胎發(fā)育以及癌癥的發(fā)生有關(guān),在快速生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞中,細(xì)胞花費(fèi)了大部分的能量用于產(chǎn)生、組裝成熟核糖體的相關(guān)成分,與核糖體生物發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄占到整個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄體系的60%以上。
除此之外,還可通過(guò)對(duì)核糖體的研究間接了解到某些基因的表達(dá)活性或在不同的脅迫條件下,特定基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量的變化。通過(guò)結(jié)合于核糖體亞基和多聚核糖體上的RNA,利用qRT-PCR技術(shù),可以直接了解到基因的表達(dá)活性。如何實(shí)現(xiàn)核糖體的分離,獲得相關(guān)信息成為了核糖體研究的關(guān)鍵。以下為利用密度梯度方法進(jìn)行核糖體分離的相關(guān)流程及方法,可供核糖體研究的相關(guān)人員參考。
在密度梯度液的制備過(guò)程中,由于層鋪法產(chǎn)生的是點(diǎn)梯度,分離效果差,故采用Biocomp公司生產(chǎn)的全自動(dòng)密度梯度制備儀進(jìn)行*線性密度梯度溶液的制備。在SW41離心管中先加入1/2體積10%蔗糖溶液,再由針頭插入底部加入1/2體積45%蔗糖梯度液(每個(gè)梯度液加入量以Biocomp提供的標(biāo)尺為準(zhǔn)),放置于Biocomp梯度制備儀中,選擇相應(yīng)的內(nèi)置程序(轉(zhuǎn)子為SW41,梯度介質(zhì)為蔗糖,梯度范圍為10-45%)運(yùn)行,便可直接獲得10-45%*線性蔗糖梯度溶液。
關(guān)于細(xì)胞樣品的處理,以培養(yǎng)的Hela細(xì)胞為例,先用PBS(pH 7.4)洗兩次,然后加入細(xì)胞裂解緩沖液,緩沖液包含50mM Tris-HCL,100mM KCL(或NaCl),5mM MgCl2,1mM DTT,100ug/ml cycloheximide(環(huán)己酰亞胺),40U/ml RNasin,以及1% NP-40和1% sodium deoxycholate(脫氧膽酸鈉)。
裂解后的細(xì)胞,首先對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行預(yù)離心,4℃,10000-13000rpm離心10min,然后取上清液上樣于10-45%蔗糖密度梯度溶液中,梯度液包含20mM Tris-HCl(pH 7.5),5mM MgCl2, 100mM NaCl以及50ug/ml cycloheximide。對(duì)于核糖體的分離多依據(jù)各組分的沉降系數(shù)的不同,因此采用速度區(qū)帶離心方法。放置離心管于Beckman超速離心機(jī)中,轉(zhuǎn)速36000-40000rpm,4℃離心2-3h,使得核糖體亞基及多聚核糖體在梯度溶液中得到分離。
核糖體分離后的收集及繪圖,手動(dòng)方法收集易產(chǎn)生分層的擾動(dòng),且無(wú)法繪制吸收峰圖。故采用Biocomp全自動(dòng)密度梯度分離系統(tǒng)進(jìn)行收集,結(jié)合紫外檢測(cè)器,檢測(cè)樣品在260nm處的吸收,實(shí)時(shí)繪制吸收峰圖。利用餾分收集器進(jìn)行分管收集樣品,通過(guò)吸收峰圖對(duì)應(yīng)的離心管號(hào),便可以直接獲得各核糖體亞基或多聚核糖體上的RNA,結(jié)合qRT-PCR等技術(shù)可進(jìn)行進(jìn)一步相關(guān)研究。
參考文獻(xiàn):
1. Adam Amsterdam, Kirsten C. Sadler and Kevin Lai et al.2004 Many Ribosomal Protein Genes Are Cancer Genes in Zebrafish. PLoS Biology 2(5): e139. doi:10.1371/journal.pbio.0020139
2. Emiliano P. Ricci, Fabrice Mure and Henri Gruffat et al. 2009. Translation of intronless RNAs is strongly stimulated by the Epstein-Barr virus mRNA export factor EB2. Nucleic Acids Research, 37(15):4932-4943
3. Lakshmi Reddy Palam, Thomas D. Baird and Ronald C. Wek. 2011. Phosphorylation of elF2 Facilitates Ribosomal Bypass of an Inhibitory Upstream ORF to Enhance CHOP Translation. The Journal of Biological Chemistry, 286(13):10939-10949
4. Marie-Cecile Didiot, Murugan Subramanian and Eric Flatter et al. 2009. Cells Lacking the Fragile X Mental Retardation Protein(FMRP) have Normal RISC Activity but Exhibit Altered Stress Granule Assembly. Molecular Biology of the Cell, 19,428-437
5. Ruiqing Yang, Sergei A. Gaidamakov and Jingwei Xie et al. 2011. La-Related Protein 4 Binds Poly(A), Interacts with the Poly(A)-Binding Protein MLLE Domain via a Variant PAM2w Motif, and Can Promote mRNA Stability. Molecular and Cellular Biology, 31, 542-556
6. Takao Mori, Chiharu Ogasawara and Toshifumi Inada et al. 2010. Dual Functions of Yeast tRNA Ligase in the Unfolded Protein Response: Unconventional Cytoplasmic Splicing of HAC1 Pre-mRNA Is Not Sufficient to Release Translational Attenuation. Molecular Biology of the Cell, 21,3722-3734