一、目的： 
學習和掌握從酵母中提制RNA 的原理和方法，從而加深對核酸性質的認識。 
二、原理： 
提取和制備RNA 的首要問題是選RNA 含量高的材料。微生物是工業(yè)上大量生產核酸的原料，其中RNA 的提制以酵母zui為理想，因為酵母核酸中主要是RNA（2.67～10.0%），DNA 很少（0.03～0.516％），而且菌體容易收集，RNA 也易于分離。此外，抽提后的菌體蛋白質（占干菌體的50%）仍具有很高的應用價值。 
RNA 提制過程首先要使RNA 從細胞中釋放，并使它和蛋白質分離，然后將菌體除去。再根據(jù)核酸在等電點時溶解度zui小的性質，將pH 調至2.0～2.5，使RNA 沉淀，進行離心收集。然后運用RNA 不溶于有機溶劑乙醇的特性，以乙醇洗滌RNA 沉淀。提取RNA 的方法很多，在工業(yè)生產上常用的是稀堿法和濃鹽法。稀堿法利用細胞壁在稀堿條件下溶解，使RNA 釋放出來，這種方法提取時間短，但RNA 在稀堿條件下不穩(wěn)定，容易被堿分解；濃鹽法是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的透性，使RNA 釋放出來，此法易掌握，產品顏色較好。使用濃鹽法提出RNA 時應注意掌握溫度，避免在20～70℃之間停留時間過長，因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶作用的溫度范圍，會使RNA 因降解而降低提取率。在90～100℃條件下加熱可使蛋白質變性，破壞磷酸二酯酶和磷酸單酯酶，有利于RNA 的提取。 
三、實驗材料、主要 儀器 和試劑 
1．實驗材料 
活性*；pH0.5～5.0 的精密試紙；冰塊。 
2． 儀器 
（1）藥物天平 
（2）三角瓶（100mL） 
（3）量筒（50mL） 
（4）水浴鍋 
（5）電爐 
（6）試管木夾 
（7）離心管 
（8）離心機（4 000r/min） 
（9）燒杯（250mL, 50mL, 10mL） 
（10）滴管及玻棒 
（11）吸濾瓶（500mL） 
（12）布氏漏斗（60mm） 
（13）表面皿（8cm） 
（14）烘箱 
（15）干燥器 
（16）紫外可見分光光度計 
3． 試劑 
（1）NaCl（化學純） 
（2）6mol/L HCl 
（3）95％乙醇（化學純） 
四、操作步驟 
1．提取 
活性*粉5g，倒入100mL 三角瓶中，加NaCl 5g，水50mL，攪拌均勻，置于沸水浴中提取1h。 
2．分離 
將上述提取液取出，立即用自來水冷卻，裝入大 離心管 內，以3 500r/min 離心10min，使提取液與菌體殘渣等分離。 
3．沉淀RNA 
將離心得到的上清液傾于50mL 燒杯中，并置于放有冰塊的250mL 燒杯中冷卻，待冷至10℃以下時，用6mol/L HCl 小心地調節(jié)pH 至2.0～2.5。隨著pH 下降，溶液中白色沉淀逐漸增加，到等電點時沉淀量zui多（注意嚴格控制pH）。調好后繼續(xù)于冰水中靜置10min，使沉淀充分，顆粒變大。 
4．抽濾和洗滌 
上述懸浮液以3 000r/min 離心10min，得到RNA 沉淀。將沉淀物放在10mL 小燒杯內，用95％的乙醇5～10mL 充分攪拌洗滌，然后在鋪有已稱重濾紙的布氏漏斗上用 真空泵 抽氣過濾，再用95％乙醇5～10mL 淋洗3 次。由于RNA 不溶于乙醇，洗滌不僅可脫水，使沉淀物疏松，便于過濾、干燥，而且可除去可溶性的脂類及色素等雜質，提高了制品的純度。 
5．干燥 
從布氏漏斗上取下有沉淀物的濾紙，放在8cm 表面皿上，置于80℃烘箱內干燥。將干燥后的RNA 制品稱重。 
6．含量測定 
稱取一定量干燥后的RNA 產品配制成濃度為10～50μg/mL 的溶液，在751 型 分光光度計 上測定其260nm 處的光密度值，按下式計算RNA 含量： 
 
式中：OD260nm 為260nm 處的光密度值；L 為比色杯的光徑（cm）；0.024 為1mL 溶液含有1μg RNA 的光密度值。 
五、結果計算 
根據(jù)含量測定的結果按下式計算提取率： 
 
六、思考題 
1．RNA 提制中注意事項是什么？ 
參考答案 
1．主要注意事項為：避開 核酸酶 作用的溫度范圍20～70℃，防止RNA 降解。同時在調pH 值時，一定要緩慢小心，且要在低溫下進行。此外，在抽濾洗滌時，要用乙醇洗滌，且不可用水洗，否則將導致RNA 部分溶解而造成損失，降低RNA 提取率。