目的要求

1．了解沉淀反應在預防醫(yī)學和獸醫(yī)學中的意義。

2．初步掌握炭疽沉淀原的制備和環(huán)狀沉淀反應，瓊脂擴散反應的操作方法。

原理  將可溶性抗原與相應的抗體混合，在適量電解質存在下，經過一定時間，即可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應。參與的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。

通常都是利用已知抗體檢查未知抗原，以診斷傳染病。但也用于以已知的抗原測定未知的抗體，以測定免疫血清的效價和診斷疫病。

操作步驟

一、環(huán)狀（以炭疽為例）

將含有抗原的透明浸出液重疊于含有抗體的免疫血清上，在兩液交界處發(fā)生環(huán)狀的白色沉淀物，即稱為環(huán)狀。

炭疽環(huán)狀又稱為阿斯可里（Ascoli）氏反應。具體操作方法如圖實9-1所示。

（一）沉淀原的制備

1．熱浸法  取被檢材料（如各種實質臟器、血液、滲出液等）1～3g，在乳缽內研碎，然后加5～10倍生理鹽水混合，用移液管吸至試管內，置于水浴鍋中煮沸15～30分鐘，用中性石棉過濾，獲得的透明濾液，即為被檢的沉淀原。如果過濾液混濁不透明，可再過濾—次。

2．冷浸法  用以檢查懷疑為炭疽病畜的皮革和獸毛等材料，操作前，先將其高壓滅菌30分鐘，以保證檢查者的安全。然后取被檢材料1g，浸于5～10倍的0.5％石炭酸生理鹽水中，在室溫下或普通冰箱浸泡14～20小時，用中性石棉過濾，透明的濾液即為沉淀原。

（二）方法與判定

用毛細吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入管內，通常達管的1/3高處，再用另一支毛細吸管吸取制備的沉淀原，沿管壁緩慢注入，使之重疊于炭疽沉淀素血清上面，達到試管的2/3高處（注意！不要發(fā)生氣泡或搖動）。直立靜置，在1～5分鐘內，兩液面交界處若出現(xiàn)清晰、整齊的環(huán)狀白輪，則為陽性。

為了驗證反應的正確性，檢驗時可做如下三種對照試驗；

1．炭疽沉淀素血清加標準炭疽沉淀原，應為陽性；

2．標準炭疽沉淀原加健康馬血清，應為陰性；

3．生理鹽水加炭疽沉淀素血清，應為陰性。

二、瓊脂擴散（以炭疽為例）

抗原、抗體在含有電解質的瓊脂凝膠基質中可以向四周自由擴散，如果二者是相應的具有特異性，則在—定部位相遇，并發(fā)生反應，出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。此種反應為瓊脂擴散。

由于一種抗原可能含有數種抗原成分，因而在凝膠中的擴散速度也不一樣，所以在凝膠中可以和抗血清形成數條沉淀線，每一條沉淀線即代表一種抗原成分。所以瓊脂擴散反應除用作微生物的鑒定、疾病診斷外，還可用作抗原成分的分析。該反應的操作方法如下：

（一）瓊脂凝膠的制備

1. 取精制瓊脂干粉1～1.2g，放入100ml含1／萬硫柳汞的磷酸緩沖液（PBS）或硼酸緩沖液（BBS）中，水浴加熱融化混勻。

2．融化后以兩層紗布夾薄層脫脂棉過濾，除去不溶性雜質。

3．將直徑90mm的潔凈平皿放在平臺上。每平皿倒入熱的瓊脂15～18毫升，厚度約2.5mm左右。注意不要產生氣泡，冷凝后加蓋，把平皿倒置，防止水分蒸發(fā)，放在普通冰箱中可保存2周左右。

4．將瓊脂平皿放于事先繪制好的圖案上，用打孔器照圖案打孔，外周孔徑為6mm，*孔徑為4mm，孔間距3mm，見圖9-2。

（三）加樣與判定

打孔后用瓊脂寫字墨水，在瓊脂板上端寫上日期及編號等。在*孔加入標準炭疽沉淀原，在外周孔1、2、3、4，各加炭疽沉淀素血清至孔滿為止。待孔中液體吸干后，將平皿倒置以防水分蒸發(fā)；將瓊脂板放入鋪有數層濕紗布的帶蓋搪瓷盤中，置15～30℃室溫或37℃恒溫箱中，24小時后，即可出現(xiàn)較粗的白色明顯的沉淀線用瓊脂擴散反應診斷傳染病，則是往*孔滴加被檢血清1滴（約0.025～0.05ml），在周圍孔滴加不同濃度的抗原各1滴，放濕盒中靜置于室溫下或37℃恒溫箱中2～5天，觀察結果。若陽性反應，則在抗原與抗體孔之間出現(xiàn)1～2條或多條白色沉淀線。陰性者，則無白色沉淀線。