目前，流式細胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞表面和細胞內(nèi)分子表達特征的分析，界定不同種類的細胞群，測定分離出的亞類純度，分析細胞的大小和總量，它可以同時分析單個細胞的多個參數(shù)。它主要用于檢測標記在抗體上的熒光強度，這些熒光抗體則可以檢測與特定細胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI)等。

染色步驟包括：將培養(yǎng)的細胞或組織樣品制成單細胞懸液，然后將細胞放入管子或酶標板中與熒光標記或未標記的抗體孵育。之后將細胞放入流式細胞儀中進行分析。

懸浮緩沖液中染色的細胞樣品通過流式細胞儀時，由于鞘液的作用被限制在液流的軸線上，從而通過一個非常小的噴嘴。這種微小的"流液束"使細胞一個接一個地通過激光，細胞/粒子通過通道時散射的光線被多個探測器檢測到。其中光柱前有一個檢測器（稱為前向角散

射或簡稱 FSC），它的旁邊有幾個檢測器（稱為側(cè)向散射或簡稱 SSC）。熒光檢測器用于檢測熒光染料本身。粒子/細胞通過光束時，將出現(xiàn)光線散射，散射會通過前向散射和側(cè)向散射被檢測到。散射和熒光數(shù)據(jù)會結(jié)合起來分析。其中前向角散射光與細胞的大小有關(guān)；而側(cè)向角散射則依賴于粒子/細胞的密度（比如胞漿顆粒數(shù)量，細胞膜尺寸），并往往以這種方式，根據(jù)不同的大小和密度的差異而將細胞群區(qū)分開來。當由相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)時，用于檢測或染色的熒光染料就會發(fā)光。這些粒子/細胞就可分別被檢測并進行數(shù)據(jù)分析。

直接染色：

直接免疫熒光染色時，細胞與直接結(jié)合有熒光染料（如 FITC 標記）的抗體孵育。它的優(yōu)點在于只需要抗體孵育這一個步驟，從而消除了來自二抗的非特異性結(jié)合的可能性。這對細胞內(nèi)染色特別有用，由于大的抗體熒光分子復(fù)合物包括二抗被困在細胞內(nèi)造成背景，或甚至無

法進入細胞，阻止了一抗的檢測。

間接染色：

間接染色時，一抗不是熒光染料直接標記的，而是通過熒光染料標記的二抗檢測。另外可選擇使用親和-*系統(tǒng)，即抗體與*結(jié)

合并且通過熒光染料標記的親和素來檢測。隨著標記二抗越來越多的應(yīng)用，可針對不同的目標蛋白制出未標記的一抗，然后用標記二抗進

行流式細胞儀分析，這拓寬了研究者對目標蛋白的選擇范圍。

細胞內(nèi)染色：

應(yīng)用流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)源性抗原在染色時，應(yīng)采取各種不同的固定和通透方法，以使抗體能接近胞內(nèi)蛋白。

任何情況下，要獲得成功的染色都必須對實驗條件進行優(yōu)化，包括測定抗體效價，采用合適的對照設(shè)定流式細胞儀，并且（如有必要）優(yōu)

化樣品的固定和通透方法。

選擇熒光結(jié)合染料

對一個給定的抗體，從陰性中分辨出陽性細胞的能力，往往取決于所用的熒光結(jié)合染料。

各種熒光染料相對強度的一般準則是，從zui亮到zui暗，PE（藻紅蛋白），PE-Cy7，PE-Cy5，APC > APC- Cy7，Alexa Fluor 47，Alexa

Fluor 700 > FITC，Pacifi c Blue，Alexa Fluor 488。這是使用信噪比的一般模式，但對于個別抗體仍有些差異。

一個高表達的抗原通?？梢员粠缀跛械臒晒鈭F分辨。一個低強度表達的抗原可能需要使用較亮的 PE 或APC，提信噪比，把未染色細胞中足夠分離出陽性細胞。

熒光染料強度的相對差異取決于儀器，這是因為在不同的儀器上激光和過濾器的組合差異。一定要使用適當?shù)腇ACS。

流式細胞術(shù)常見問題分析

無信號/熒光強度弱

不正確的信號補償

檢查流式細胞儀陽性單一顏色對照是否正確，通道和補償設(shè)置是否能正確地捕獲所有粒子。

沒有足夠的抗體來檢測

增加抗體的量/濃度

無法接近細胞內(nèi)目標

檢查目標蛋白是否在細胞內(nèi)。對于胞內(nèi)染色，確保有足夠的通透性。為防止細胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，該過程應(yīng)用冰冷的試劑，在冰上或 4 °C

進行，以終止一切反應(yīng)。加入疊氮鈉可防止表面抗原的修飾和內(nèi)化帶來的熒光強度的損失。對于細胞系染色，*可以引起細胞表面

蛋白質(zhì)的內(nèi)化，尤其是細胞表面分子，可能需要更溫和的分離方法。

細胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大

對細胞內(nèi)染色實驗，熒光分子應(yīng)具有較小的分子量。大分子量熒光染料會降低抗體的動力和其進入細胞的可能性。

激光器未對齊

確保流式細胞儀的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微球來調(diào)整路線。如果激光器不能正確對準或發(fā)生漂移時，您可能需要考慮

此機的客服。

目標蛋白不存在或處于低水平表達

確保組織或細胞類型表達的目標蛋白處于一個足夠檢測的量。

可溶性或分泌型目標蛋白

目標蛋白是否可溶并從細胞內(nèi)分泌？需要嵌合在細胞膜上或存在于細胞質(zhì)里以便流式細胞儀能很容易檢測到。通過高爾基體封閉的步驟，

比如加入 Brefaldin A，可提高細胞內(nèi)染色信號。

補償過高或增益過低

使用陽性對照再次設(shè)置流式細胞儀，利用補償以確保細胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強信號（在合理的范圍內(nèi)）。

熒光分子的熒光逐漸消退

抗體可能放置時間太長或沒有避光，新鮮抗體是必需的。

一抗和二抗不匹配

二抗應(yīng)該是和一抗來源物種相同（例如*抗體來源于兔，就要使用抗兔的第二抗體）。

熒光強度過高

抗體濃度過高

這將導(dǎo)致較高的非特異性結(jié)合或非常高的熒光強度。減少每個樣本中加入的抗體量。

過量抗體被困

這是細胞內(nèi)染色*的問題，較大的熒光分子使抗體被困在細胞中。確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton。

封閉不足

與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑。

背景高或陽性細胞百分比高

增益設(shè)置過高或補償過低

使用陽性對照再次設(shè)置流式細胞儀，用補償減少小顆粒背景并減少增益以降低信號。

抗體過量

降低抗體濃度。您還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，以確保洗去多余的抗體。__

觀察到兩個或多個細胞群但應(yīng)該只有一群細胞

不止一類細胞表達目的蛋白

檢查樣品中所有細胞類型的預(yù)期表達水平，如果必要確保細胞充分分離。

出現(xiàn)細胞雙峰

細胞雙峰在圖上顯示兩倍的熒光強度的第二種細胞類型。染色前輕輕地混合細胞，在放入流式細胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過

濾細胞以除去團塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。

側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）

細胞裂解

確保樣品中細胞沒有裂解和破裂。樣品應(yīng)是新鮮的并且是正確制備的。細胞不能高轉(zhuǎn)速離心或劇烈震蕩。

細菌污染

確保樣品不受污染。細菌會低水平自發(fā)熒光，這也會導(dǎo)致高粒子率。

低粒子率

每毫升的細胞數(shù)量太少

制備 1 × 10 6 個細胞/ml。確保細胞充分混合（操作要輕）。

細胞聚集，阻塞管道

染色前輕輕吹打幾次確保形成同源單細胞懸液。確保運行之前再次混勻。在的情況下，可篩選或過濾細胞以去除團塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。