酶切實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用限制性核酸內(nèi)切酶(Restriction endonuclease)EcoRI 切割λDNA及質(zhì)粒pBR322DNA,瓊脂糖凝膠電泳后觀察酶切結(jié)果。
【原理】
λDNA 是大腸桿菌的一種溫和噬菌體DNA,雙股線狀,分子大小為48.5 kb。 EcoRI酶可識別DNA中 G↓AATTC核苷酸序列,并在箭頭處將其切開。λDNA含有5個EcoRI酶識別位點(diǎn),可將λDNA切成6個大小不同的片斷。pBR322 DNA為人工構(gòu)建的質(zhì)粒dna, 分子大小為4.3 kb,含有1個EcoR I酶切點(diǎn),切割后由環(huán)狀DNA變?yōu)榫€形DNA。
【材料】
1.λDNA(0.1ug/ul),pBR322 DNA(0.25 ug/ul)
2.限制性內(nèi)切酶EcoRI
3.EcoRI 酶切緩沖液(Buffer solution 10×)
4.去離子水
5.電泳及染色用材料
【方法】
1.取潔凈EP管2只,按表10-1加入各成分。
2.混勻,放370C水浴1-2h。65℃水浴10min,再放4℃冰箱8min終止反應(yīng)。部分酶切DNA片段用于DNA連接實(shí)驗(yàn),另一部分放4℃冰箱,待瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(二)DNA連接實(shí)驗(yàn)
T4 DNA 連接酶是一單鏈多肽,分子量為68,000道爾頓,它能催化雙鏈DNA上相鄰的3ˊ羥基和5ˊ磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。λDNA用EcoRI酶切割后形成的6個片斷均具有粘性末端(Cohesive ends),在T4 DNA 連接酶作用下,可連接成原來的線狀DNA
【材料】
1.λDNAEcoRI酶切片段
2.T4 DNA連接酶
3.T4 DNA連接酶緩沖液(10×)
4.去離子水
【方法】
1.取潔凈EP管1只,分別加入:
①去離子水 7ul,
②T4 DNA連接酶緩沖液(10×) 2 ul,
③λDNA酶切片段(已65℃10分鐘滅活)10ul
④T4 DNA連接酶1ul
2.混勻后,放13℃水浴過夜,待電泳檢測。