核糖核酸酶保護(hù)實驗(Ribonuclease protection assay，RPA)是近十年發(fā)展起來的一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針(32P或)與待測的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA;未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實驗。對于32P標(biāo)記的探針，雜交雙鏈進(jìn)行變性聚丙酰胺凝膠電泳，用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測被保護(hù)的探針的信號;對于標(biāo)記的探針，雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，采用鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測雜交信號。
RPA是一種有力的工具，可用于檢測在總RNA混合物中特定mRNA分子的表達(dá)。盡管操作比較復(fù)雜，但是這種方法可以在一次檢測中分析多達(dá)25樣品。敏感性和高通量的優(yōu)點使得RPA在病原體的發(fā)現(xiàn)中顯得非常有用。由RPA得到的結(jié)果，結(jié)合普通的形態(tài)學(xué)技術(shù)有助于闡明疾病的發(fā)生過程。
RPA有Northern blot*的優(yōu)勢：
1.過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加*
2.RPA比Northern Blot靈敏15-150倍，適合檢測各種表達(dá)水平之基因
3.RPA通量高，同時檢測多個基因，可評價他們在同一情況下的差異表達(dá)
4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度
這個方法的的主要缺點如下：
1.這個實驗的前提是你必須首先要把要研究的基因克隆于一個載體，要清楚插入片段的方向，該載體插入片段兩側(cè)有T3、T7或SP6的啟動子位點。載體先要用合適的內(nèi)切酶線性化，選擇正確的體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，轉(zhuǎn)錄出要研究的mRNA 的互補鏈，再純化。總之RNA探針的制備夠麻煩。
2.核酸酶消化時，酶量的控制困難，容易消化過頭，X片上什么都沒有。
3.要用放射性同位素。從事生物研究的人誰不接觸放射性物質(zhì)?但是該方法中不同于一般的探針標(biāo)記，體積小，防護(hù)容易。它需要做垂直板狀PAGE，還要漂洗固定，粘有放射性的物質(zhì)太多，如電泳的緩沖液、電泳槽、玻璃板、漂洗固定液及托盤。這還沒有算上RNA探針標(biāo)記及隨后的純化過程。
可能出現(xiàn)的問題及應(yīng)對措施：
1.No Discrete Bands, Only Smears--RNA degraded, or the the RNase Digestion was too harsh.Try reducing the concentration of RNase A to 1 mg/ml or digest for a shorter period of time. Check your RNA for condition.
2.Bands Too Large, High Molecular Weight Artifacts--The RNase Digestion was inefficient and unable to effectively trim down the RNA:RNA duplexes.Try RNasing longer or increasing the RNase concentration. /Incompley linearized template DNA.
3.Bands in the Negative Control Lane-- Inefficent RNase Digestion (see above)/Sense template contaminating riboprobe/Insufficent DNase digestion of riboprobe.
4.Many Lower Molecular Weight Bands Under the Main Band--There can either be premature stop sites in the probe leading to smaller probe sizes, therefore smaller products. This can also stem from overdigestion by RNase A which will break-up the duplexes if the concentration or digestion time is too long.
5.No Signal At All: You did generate an antisense probe right?
RPA和SAGE的相同點和不同點：
兩者的相同點都在于根據(jù)不同的RNA分子有不同的特征序列，以此為依據(jù)，分析基因的表達(dá)情況;兩者的不同點在于，具體檢測RNA的原理不一樣，相比較而言，前者利用RNase只消化單鏈RNA(即未與RNA probe結(jié)合的RNA分子)的特性，定性兼半定量分析特定(視合成的probe)基因的表達(dá)，后者是基于只需14bp長的核酸序列即可代表一個RNA分子，用擴(kuò)增的方式，定性的研究可以檢測到一個細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄體的表達(dá)
