一、實驗?zāi)康?/span>
1．了解微核測試的原理和毒理遺傳學(xué)在實際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義
2．學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測試技術(shù)
二、實驗原理
微核簡稱(MCN)，是真核生物細胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。在細胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應(yīng)在主核1／3以下。微核的折光率及細胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實驗也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細胞分裂末期被兩個子細胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經(jīng)證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進行微核測試與以動物進行的一致率可達99%以上。目前微核測試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護、化學(xué)誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
利用蠶豆根尖作為實驗材料進行微核測試，可準確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測。
三、實驗材料
松滋青皮豆（蠶豆）種子
四、實驗器具和藥品
實驗器具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙
實驗藥品：氯化鈷
五、實驗過程
1．實驗材料的培育
蠶豆根尖細胞的染色體大，DNA含量高．因而對誘變因子反應(yīng)敏感。松滋青皮豆是從不同蠶豆品種中篩選出來的一種較為敏感的品種。本品種引入后在栽培繁殖時要注意不要同其它蠶豆品種種在一起，不噴灑、以保持該品種較低的本底微核值。也可用其它蠶豆品種，但是必須設(shè)置對照組。種子成熟后，曬干貯藏于干燥器內(nèi)或4℃冰箱內(nèi)備用。
2．浸種催芽：將實驗用蠶豆種子按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25℃下浸泡24小時，此間至少換水兩次．所換水應(yīng)25℃預(yù)溫。種子吸脹后；用紗布松散包裹置白磁盤中，保持濕度，在25℃溫箱中催芽12－24小時，待初生根長出2—3mm時，再取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的磁盤中，25℃繼續(xù)催芽，經(jīng)約36～48小時．大部分初生根長至1～2cm左右，根毛發(fā)育良好，這時即可用來進行檢測了。
3． 處理
用被檢測液處理根尖，每一處理選取6－8粒初生根尖生長良好、根長一致的種子，放入盛有被檢測液的培養(yǎng)皿中，被檢測液浸泡根尖。同時，取另一培養(yǎng)皿以蒸餾水處理根尖，作為對照。
處理時間約為6小時（此時間可根據(jù)實驗要求和被檢測液的濃度等情況而定）。
4．根尖細胞恢復(fù)培養(yǎng)
將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2－3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙或脫脂棉的白磁盤內(nèi)25℃溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)22－24小時。
5．固定根尖細胞
將恢復(fù)后的種子從根尖頂端切下1cm長的幼根放入廣口瓶中，以卡納氏固定液進行固定2-24小時后，保存于70%乙醇溶液中。
6．鏡檢及微核識別標準
常規(guī)制片后，將玻片標本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區(qū)細胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分轉(zhuǎn)到高倍鏡下進行觀察。
微核識別標準：
（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。
（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。
（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。
每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數(shù)1000個細胞中的微核數(shù)并進行記錄。