一、器材與試劑： 
干粉型培養(yǎng)基、，、. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。 
具體步驟： 
(1)水的制備： 
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水. 
(2)PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-hanks液的配制)： 
1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。 
2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。 
(3) 溶液的配制與消毒： 
的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)的作用反應(yīng)不一樣。分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，溶液的作用能力zui強(qiáng)。使用時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+ 、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低的活性，所以配制溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+ 、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者抑制劑終止對(duì)細(xì)胞的作用。 
1.稱取：按液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。 
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。 
(4)青、溶液的配制于消毒 
1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 
2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 
3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青的濃度zui終為100單位/ml。1單位＝1微克 
(5)RPMI1640的制備與消毒： 
1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青液各0.5ml, 使青的濃度zui終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。 
2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 
3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。 
4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。 
5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml溶液（4℃時(shí)兩周有效）。 
(6)血清的滅活： 
細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。 
(7)HEPES溶液： 
HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。 
1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下： 
準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4℃保存。 
注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可*（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。 
(8)： 
合成培養(yǎng)基中都含有較大量的，其作用非常重要，細(xì)胞需要合成核酸和蛋白質(zhì)，缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的。由于在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的。 
一般培養(yǎng)液中的含量為1～4mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml溶液。 
(9)肝素溶液的配制： 
含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中zui終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為­­ ℃ 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（可加入0.9ml）即可。 
(10) Ⅰ型膠原酶： 
0.1％Ⅰ型同一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。 
(11)明膠溶液： 
因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是0.1%的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。 
(12)其他培養(yǎng)用液的配制： 
20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子， 
注意事項(xiàng)： 
1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。 
2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。 
3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值z(mì)ui終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。