站在共聚焦成像與雙光子顯微術(shù)的高水平上

尼康A(chǔ)1R MP 是一款雙光子顯微成像系統(tǒng)，不僅具備高分辨率檢流計(jì)式掃描器（galvanometer scanner），而且還配備了高速共振式掃描器（resonant scanner）。掃描速率在512 × 512像素水平下高達(dá)到30幀/秒；在帶狀掃描模式下可達(dá)420幀/秒。新型四通道NDD探測(cè)器（non-descanned detectors）具有更高的探測(cè)效率、更低的暗電流以及更寬的響應(yīng)光譜，可以對(duì)譜線相近的熒光探針進(jìn)行實(shí)時(shí)光譜拆分與識(shí)別，并大大提高熒光圖像的對(duì)比度。此功能對(duì)于雙光子顯微鏡非常重要，因?yàn)樵陔p光子成像時(shí)一般只能使用單一的激發(fā)波長(zhǎng)，往往不可避免地造成自發(fā)熒光以及發(fā)射光譜的重疊。

高達(dá)420幀/秒成像速率的共振掃描鏡

尼康所的共振掃描技術(shù)，較之于非共振的普通掃描器，大幅提高了寬視場(chǎng)掃描速率，達(dá)到了點(diǎn)掃描成像的快速率-420幀/秒。利用多光子顯微術(shù)專用的NDD探測(cè)器，可以對(duì)非常厚的標(biāo)本進(jìn)行深部快速成像。尼康的光學(xué)同步（optical pixel clock）技術(shù)充分保證了超高速圖像的均勻性和穩(wěn)定性。

*1 NDD（Non-Descanned Detector）,與共聚焦技術(shù)不同，A1R MP不需要使用小孔濾波（descan）。使得NDD探測(cè)器可以安裝在最靠近物鏡出光口的位置，從而可以接收到更多的被厚標(biāo)本散射的信號(hào)光，大幅提高靈敏度。

活體微循環(huán)成像

通過A1R MP的超高速共振掃描，利用紅外飛秒脈沖激光激發(fā)活體組織血管中的血細(xì)胞，并以30幀/秒（30msec）速率，三通道同時(shí)拍攝三色熒光圖像。

箭頭標(biāo)記的是對(duì)白細(xì)胞胞核運(yùn)動(dòng)的追蹤。

三種熒光探針同時(shí)成像：細(xì)胞核（藍(lán)），內(nèi)皮細(xì)胞層（綠），血漿（紅）。長(zhǎng)波長(zhǎng)超快激光與超高速掃描器的結(jié)合有效降低光損傷的同時(shí)提供了高精度時(shí)間分辨率的多光子成像。圖像分辨率：512×512pixels，圖像采集速率：30幀/秒，物鏡：60x水鏡。

高靈敏度NDD深部成像

尼康新開發(fā)的多光子四通道NDD探測(cè)器能夠有效地進(jìn)行標(biāo)本深部的顯微成像。較普通探測(cè)器而言，NDD的感光元件面積更大，靈敏度更高，并安裝于距離物鏡后出光口（back aperture）最近的地方. 該配置有效地提高了對(duì)散射熒光的探測(cè)效率，具有更高的信噪比（S/N），對(duì)諸如活體組織等較厚的標(biāo)本的拍攝，具有比普通共聚焦顯微鏡更為清晰穩(wěn)定的圖像質(zhì)量。

對(duì)于標(biāo)本深部成像來說，非常重要的一點(diǎn)就是要盡可能多地探測(cè)到散射熒光。而實(shí)際探測(cè)深度主要取決于探測(cè)器的靈敏度、受光面積以及安裝位置。

13.5日齡大鼠胚胎脊髓原基（神經(jīng)管）的深部成像。樣品為電轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白并培養(yǎng)24h后的完整胚胎。固定好的橫切脊髓浸入凝膠中，并用紅外脈沖激光進(jìn)行雙光子激發(fā)，可以觀察到600微米以上的深部區(qū)域。

NDD探測(cè)器拍攝的固定小鼠大腦神經(jīng)元標(biāo)本（eGFP染色）通過雙光子紅外激光（920nm）可以獲得比常規(guī)共聚焦更高信噪比（S/N)的腦組織深部成像。能夠?qū)崿F(xiàn)深度在600微米以上光學(xué)切層觀察。實(shí)驗(yàn)中使用了新型CFI Apo LWD 40x WI λs物鏡。

新款高NA物鏡成像更清晰，更明亮

新款水浸物鏡在較寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)做了色差校正，保證了在近紫外到近紅外波段內(nèi)都有很高的透過率。其中尼康的CFI Plan Apo IR 60x WI是目前世界上數(shù)值孔徑（NA）的60x水浸物鏡，用它拍攝的高對(duì)比度顯微圖像具有非常出色的亮度和分辨率。

一種原來為尼康半導(dǎo)體光刻機(jī)開發(fā)的超低折射率薄膜。由納米顆粒組成海綿狀“粗糙”結(jié)構(gòu)，從而在很寬的光譜區(qū)間上大幅提升了光線透過率。

尼康雙光子顯微鏡物鏡

N 納米水晶鍍膜（Nano Crystal Coat-deposited）

圖一 圖二 圖三

（圖一）轉(zhuǎn)染GFP的13.5日齡大鼠胚胎脊髓原基（神經(jīng)管），標(biāo)本為經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后并固定的完整胚胎。神經(jīng)上皮細(xì)胞與遷移中間神經(jīng)元的連合軸突都清晰可見。

（圖三）表達(dá)eGFP小鼠大腦神經(jīng)元的固定標(biāo)本圖像通過雙光子紅外激光（920nm）可以獲得比常規(guī)共聚焦更高信噪比（S/N）的腦組織深部成像。

快速精準(zhǔn)的光譜拆分

A1R MP不僅可以通過光譜探測(cè)器進(jìn)行32通道光譜拆分，而且實(shí)現(xiàn)了利用四通道NDD探測(cè)器的光譜拆分功能。此功能同樣適用于高速共振掃描器。因此，A1R MP可以實(shí)現(xiàn)厚標(biāo)本的深部高速高對(duì)比度成像。

經(jīng)Alexa488、MitoTracker Red和DAPI染色的標(biāo)本，由光譜探測(cè)器拍攝的雙光子激發(fā)圖像并經(jīng)光譜拆分處理。雙光子紅外激發(fā)光能夠有效減少對(duì)細(xì)胞的損傷。

多光子激光光束的一鍵準(zhǔn)直

當(dāng)多光子激光的波長(zhǎng)或群速色散（GVD）預(yù)補(bǔ)償發(fā)生改變時(shí)，激光的位置會(huì)發(fā)生偏移，導(dǎo)致熒光圖像亮度不均勻，以及單光子圖像與雙光子圖像之間的錯(cuò)位。

由于人眼無法看見多光子激光，特別是800 nm以上波長(zhǎng)。因此多光子激光束的準(zhǔn)直工作對(duì)普通用戶來說是十分困難也是十分危險(xiǎn)的。尼康的A1R MP新開發(fā)的自動(dòng)光束準(zhǔn)直功能可以讓用戶輕點(diǎn)鼠標(biāo)，瞬間完成多光子激光的光束準(zhǔn)直。