Configuration-specific Monoclonal Antibody Based 

Cdc42 Activation Assay Kit 

Catalog Number：80701 

20 assay

產(chǎn)品說明

       小G蛋白是從屬于細胞調節(jié)因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種， Cdc42參與生理活動過程中其分子結構會呈現(xiàn)出2種相互轉換的形式：與GTP結合的激活狀態(tài)和與GDP結合的非活性狀態(tài)。

       目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據(jù)小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結合區(qū)域（PBD）結合，使PAK活化從而發(fā)揮生物學功能，進而間接的進行Cdc42活性功能的監(jiān)測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結合蛋白與p21結合區(qū)域之間較低的親和力，導致這種檢測方法的重復性較差。

        紐斯特生物技術有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結合蛋白，而不識別Cdc42-GDP結合蛋白，進而簡單并且快速的進行Cdc42的活性檢測。同時試劑盒中的Cdc42-GTP單克隆抗體也可以進行免疫組化實驗中細胞和組織中Cdc42的活性監(jiān)測。每套試劑盒可以進行20次檢測。

檢測原理

     武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行GTPγS活化處理）活性Cdc42-GTP的水平。簡言之，特異性識別Cdc42活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用特異性識別Cdc42活化構象的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

試劑盒成分

1. 特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體（Anti-active Cdc42, Mouse MonoclonalAntibody (Catalog No. 26905)）：小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml)，抗體溶于PBS（pH7.4）并包含50%的甘油和0.05%的。此抗體可以特異性識別所有脊椎動物中的Cdc42-GTP。

2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul包含200ul Protein A/G agarose     和200ul 20%乙醇溶液。（使用時溶液需要充分混勻，再吸?。?/p>

3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL包含250 mM Tris-HCl (pH 8.0),     750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4. 特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體（Anti-Cdc42, Rabbit Polyclonal Antibody  (Catalog No.21010)）：小管裝--30ul (抗體濃度是1mg/ml)，抗體溶于PBS（pH 7.4）并包含有   50%的甘油。

5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實驗中0.5mL細胞裂解液使用      5ul GTPγS標記。

6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實驗中0.5mL細胞裂解液使用5ul GDP標記。

儲存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于4°C條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實驗者自行配置）

1.  刺激和未刺激的細胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制劑；

3.  4 °C 搖桿或者搖床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  電泳和免疫印跡相關試劑；

8.  免疫印跡緩沖液TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9.  免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝酸纖維素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 檢測試劑；

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mL aprotinin（）。

樣品處理

貼壁細胞

1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用27?的注射器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

懸浮細胞

1. 培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2. 計數(shù)細胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

5. 反復吹打細胞進行裂解。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用27?的注射器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照

注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有10%的Cdc42被激活，而在體外用GTPγS處理大約有90%的Cdc42被激活。

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入0.5 mL的細胞提取物（如果是純的Cdc42蛋白則每個管中加入的蛋白量為1ug）。

2. 每個管中加入20ul 0.5M EDTA(終濃度即為20 mM)。

3. 一個管中加入5ul的100X GTPγS（終濃度即為100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入5ul的100X GDP（終濃度即為1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于30°C條件下反應30min并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為60mM)。

檢測步驟

Ι。活性Cdc42 Pull-Down實驗

1. 等分0.5-1 mL的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入1mL的1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入1ul的活性Cdc42單克隆抗體。

4. 用渦旋振蕩儀將protein A/G凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出20ul懸浮珠漿液加入離心管中。

5. 將管置于4°C條件下孵育1H，并輕輕的進行搖動。

6. 5000g，離心1分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用0.5 mL的1X Assay/Lysis緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用20ul的2X SDS-PAGE樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸5min。

12. 5000g，離心10s。

II. 電泳和轉膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到PVDF或硝化纖維素膜。

III.免疫印跡反應和檢測（所有步驟都是在室溫下進行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入99%甲醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如ECL顯色法。

示例結果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術有限公司的Cdc42活性試劑盒的典型結果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

Cdc42活性分析。小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）用表皮細胞因子（EGF）處理（Lane 2）和未處理（Lane 1）。細胞裂解物用特異性識別Cdc42活性構象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26905)孵育(上圖)?；钚訡dc42珠子顆粒用特異性識別Cdc42活性構象的兔多克隆抗體(Cat # 21010)進行免疫印跡實驗。底部的圖展示的是細胞裂解液的活性Cdc42的Western blot實驗結果。（底圖SDS-PAGE的上樣量是上圖SDS-PAGE上樣量的5%。）