別名:CDK4I, INK4B, MTS2, P15, TP15, p15INK4b, CDK inhibitory protein|CDK4B inhibitor|cyclin-dependent kinase 4 inhibitor B|cyclin-dependent kinase inhibitor 2B|cyclin-dependent kinases 4 and 6 binding pr

靈敏度:7.81 pg/ml

Human CDKN2B ELISA kit     

【預(yù)期應(yīng)用】ELISA 法定量測(cè)定血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、組織裂解液中CDKN2B     含量。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

1、檢測(cè)范圍：15.6 pg/ml-1000 pg/ml

2、靈敏度：3.9 pg/ml

3、精密度：批內(nèi)差CV%<8%，批間差CV%<10%

Human CDKN2B ELISA kit     

【實(shí)驗(yàn)原理】

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗CDKN2B     抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、

*化的抗CDKN2B     抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過(guò)

氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣本中的CDKN2B     呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣本濃度。

【試劑盒組成成分】

組份48T/96T

酶標(biāo)板 (Assay plate) 12 條×8 孔

標(biāo)準(zhǔn)品 (Standard) 2 瓶 (凍干品)

*標(biāo)記抗體 (Biotin-antibody) 1 x 120 μl/瓶 (100×)A

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 (HRP-avidin) 1 x 120 μl/瓶 (100×)

*標(biāo)記抗體稀釋液 (Biotin-antibody Diluent) 1 x 15 ml/瓶

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent) 1 x 15 ml/瓶

* (Sample Diluent) 1 x 50 ml/瓶

濃洗滌液 (Wash Buffer) 1 x 20 ml/瓶 (25×)

底物溶液 (TMB Substrate) 1 x 10 ml/瓶

終止液 (Stop Solution) 1 x 10 ml/瓶

板貼4

【所需試劑和器材】

標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀；高速離心機(jī)；電熱恒溫培養(yǎng)箱；干凈的試管和離心管；容量瓶；

系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭；多通道移液器；蒸餾水等

【樣本采集及保存】

1、血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4°C 過(guò)夜后于2 - 8°C 1000 x g 離心15 分鐘，取

上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20°C 或-80°C 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

2、血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g 離心15

分鐘，取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反

復(fù)凍融。解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

3、細(xì)胞培養(yǎng)物上清：標(biāo)本于2 - 8°C 1000 x g 離心15 分鐘取上清，上清立即用于實(shí)驗(yàn)，或

分裝后于-20°C 或-80°C 保存。避免反復(fù)凍融。

4、組織裂解液：取100mg 組織，用1X PBS 洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入1 ml 1X PBS，制成勻漿，然后置于-20°C 過(guò)夜。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融2 次處理破壞細(xì)

胞膜后，將組織勻漿于2 - 8°C 5000 g 離心5 分鐘取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，

或?qū)⑸锨宸盅b保存于-20°C 或-80°C 。解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。避免反復(fù)凍

融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

【試劑配制】

1、 標(biāo)準(zhǔn)品

(1) 從試劑盒中取出一支標(biāo)準(zhǔn)品，于6000-10000rpm 離心30 秒。用1ml *溶解，并

用吸頭對(duì)準(zhǔn)凍存管底部反復(fù)吸打5 次以助溶解，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品S7，放置備用。

(2) 取7 個(gè)1.5 ml 離心管(S0-S6)依次排列，各加入250μl *。吸取250μl 標(biāo)準(zhǔn)品

S7 到*個(gè)離心管中(S6)，輕輕吹打混勻。從S6 中吸取250μl 到第二個(gè)EP 管中(S5)，

輕輕吹打混勻。以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋。S0 為*。

2、 洗液工作液

濃洗滌液按1:25倍用去離子水進(jìn)行稀釋。例如用量筒量取240ml去離子水，倒入燒杯或其

他潔凈容器中，再量取10ml濃洗滌液，均勻加入，攪拌混勻，在臨用前配妥。濃洗滌液低溫保

存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

3、 *標(biāo)記抗體工作液

*標(biāo)記抗體液按1:100倍用*標(biāo)記抗體稀釋液進(jìn)行稀釋。如10μl*標(biāo)記抗體加

990μl*標(biāo)記抗體稀釋液，輕輕混勻，在臨用前10分鐘內(nèi)配妥。

4、 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素按1:100倍用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液進(jìn)行稀釋。如

10μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液，輕輕混勻，在臨用

前10分鐘內(nèi)配妥。

     【重要提示】

1、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭Ｔ噭┗驑颖鞠♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起

泡。

2、用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便管蓋和管壁上的液體集中到

管底。

3、在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

4、 因?qū)嶋H裝量多于標(biāo)示裝量，配制工作試劑請(qǐng)用精準(zhǔn)的計(jì)量工具（移液器或量筒等）量取，

切勿不經(jīng)量取直接使用。

5、標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算

好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.4ml。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)

的標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

6、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋請(qǐng)勿于板中進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)于臨用前15 分鐘內(nèi)配制。為保證實(shí)驗(yàn)有效性，

建議每次實(shí)驗(yàn)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品。若保存得當(dāng)，溶解后的標(biāo)準(zhǔn)品S7 可在2-8℃保存，7 天內(nèi)

使用有效。

     【操作步驟】

1、將各種試劑移至室溫（18-25℃）平衡至少30 分鐘，按前述方法配制試劑，備用。

2、加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100μl，輕輕晃動(dòng)混

勻，覆上板貼，37℃溫育2 小時(shí)。

3、棄去液體，甩干，不用洗滌。

4、每孔加*標(biāo)記抗體工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 小時(shí)。

5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次。每次浸泡2 分鐘，200μl/每孔，甩干。

6、每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 小時(shí)。

7、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每次浸泡2 分鐘，200μl/每孔，甩干。

8、依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色15-30 分鐘。

9、依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)。

10、在反應(yīng)終止后5 分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。

     【操作要點(diǎn)】

1、為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本均設(shè)雙孔測(cè)定。每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先用*進(jìn)行稀釋，以使樣本符合試劑盒的檢測(cè)范

圍，zui后計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

3、 加樣：加樣時(shí)，請(qǐng)使用一次性的潔凈吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡，

將樣本加于酶標(biāo)板孔底部，切勿沿孔壁加樣。一次加樣時(shí)間控制在10 分鐘內(nèi)，如標(biāo)

本數(shù)量多，*使用移液器加樣。

4、 溫育：為防止樣本蒸發(fā)或污染，溫育過(guò)程中酶標(biāo)板必須覆上板貼，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶標(biāo)板應(yīng)避

免處于干燥的狀態(tài)。溫育過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)觀察溫箱溫度是否恒定于37℃，及時(shí)調(diào)整。溫育

過(guò)程中，溫箱不易開(kāi)啟太多次，以免影響溫度平衡。

5、 洗滌：洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

(1) 手工洗板方法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪

墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將*的洗滌緩沖液按200μl/孔注入孔內(nèi)，

浸泡2 分鐘。根據(jù)操作步驟中所述，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

(2) 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

6、 顯色：為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液?？稍诩尤氲孜锶?/span>

液后每隔一段時(shí)間觀察一下顯色情況以控制反應(yīng)時(shí)間（比如每隔10 分鐘）。當(dāng)肉眼可見(jiàn)標(biāo)

準(zhǔn)品前3-4 孔有明顯梯度藍(lán)色，后3-4 孔顯色不明顯時(shí)，即可加入終止液終止反應(yīng)，此時(shí)

藍(lán)色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

7、底物溶液應(yīng)為淺藍(lán)色或無(wú)色，如果顏色嚴(yán)重變深則必須棄用。底物溶液易受污染，請(qǐng)避光

妥善保存。

     【數(shù)據(jù)處理】

可將標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值減去S0 孔數(shù)值后繪制曲線，如果設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)

準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD 值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲

線。*使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，可從我們的下載專業(yè)軟件"Curve Expert 1.3"，

并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD 值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；或用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度

與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣本的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣本濃度。若樣

本檢測(cè)前進(jìn)行過(guò)稀釋，zui后計(jì)算時(shí)需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為樣本的實(shí)際濃度。

     【說(shuō)明】

1、本試劑盒僅供研究使用。

2、中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不*之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn)。

3、本操作說(shuō)明也適用于48T 試劑盒。48T 試劑盒中酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體及辣根

過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素?cái)?shù)量減半。

4、不同批號(hào)試劑不能混用。不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

5、剛開(kāi)啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何

影響。

上海逸研生物科技有限公司專業(yè)從事于elisa試劑盒的銷售及elisa待測(cè)服務(wù)，代理國(guó)內(nèi)外的elisa試劑盒，并自主研發(fā)常規(guī)elisa試劑盒，質(zhì)量*，*，歡迎廣大客戶和訂購(gòu)，代理品牌：RD代理、eBioscinece代理、biovision代理、華美CUSABIO代理、優(yōu)爾生代理、博士德代理等。

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