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本試劑僅供研究使用
試驗原理:
MMP-1 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知MMP-1濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將MMP-1 和*標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中MMP-1的濃度呈比例關系。
試劑盒內容及其配制
試劑盒成份(2-8℃保存)
96孔配置
48孔配置
配制
96/48人份酶標板
1塊板(96T)
半塊板(48T)
即用型
塑料膜板蓋
1塊
半塊
即用型
標準品:40ng/ml
1瓶(0.6ml)
1瓶(0.3ml)
按說明書進行稀稀
空白對照
1瓶(1.0ml)
1瓶(0.5ml)
即用型
標準品稀釋緩沖液
1瓶(4.0ml)
1瓶(2.0ml)
即用型
*標記的抗caspase-3 抗體
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
親和鏈酶素-HRP
1瓶(8.0ml)
1瓶(4.0ml)
即用型
洗滌緩沖液
1瓶(20ml)
1瓶(10ml)
按說明書進行稀釋
底物A
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
底物B
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
終止液
1瓶(6.0ml)
1瓶(3.0ml)
即用型
標本稀釋液
1瓶(12ml)
1瓶(6.0ml)
即用型
自備材料
蒸餾水。
加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘,取上清液
保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
40 ng/ml
(6號標準品)
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
20 ng/ml
(5號標準品)
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
10 ng/ml
(4號標準品)
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0 ng/ml
(3號標準品)
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 ng/ml
(2號標準品)
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
1.25 ng/ml
(1號標準品)
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml
(空白對照)
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。
洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1:1稀釋后加入50ul于反應孔內。
加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
標準品濃度(ng/ml)
A
40
40
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
B
20
20
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
C
10
10
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
D
5.0
5.0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
E
2.5
2.5
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
F
1.25
1.25
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
G
0
0
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
H
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
樣品
局限
6號標準品以上的結果為非線性的,根據(jù)此標準曲線無法得到的結果。
試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性:不與其它細胞因子反應。
3. 重復性:板內、板間變異系數(shù)均小于10%。
結 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的caspase-3 標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的caspase-3 含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值范圍:0-40ng/ml
4、敏感度: 0.1 ng/ml
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