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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：463發(fā)布時間：2013-11-13
動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數(shù)目，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足足數(shù)目的血清，用于免疫的動物應(yīng)適齡，健壯，無感染性疾患，為雄性，此外還需十分留意動物的飼養(yǎng)，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。在無菌前提，吸出血清，分裝（0.05～0.2ml），貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi)，耳露于箱（籠）外，也可由另一人抓住兔身。為避免損失抗原，亦可用一打針器裝抗原液，另一打針器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者往返反復抽吸，約數(shù)十分鐘后即能*乳化。交叉反應(yīng)率一般是用競爭按捺曲線來判定的。若用兔，用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。
家兔是zui常用以產(chǎn)生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。通常，特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭按捺曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各安閑IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。二禮拜后，可在另一耳放血。此法可反復多次放血。
作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關(guān)資料。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的*片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，平均后再邊磨邊滴加入等容積抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再繼承研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內(nèi)*不擴散為止。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。
收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm，10min。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，二是頸動脈入血，也可心臟采血。加強免疫時用不*佐劑，免疫時皮下打針百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不必打針百日咳疫苗。特異性好就是抗血清的識別能力強，當抗體效價達到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清?？乖瓌┝?，劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為劑量為1/4左右。 C冰箱保留。檢查合格后即以其中一打針器作打針用。佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使介入免疫反應(yīng)的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產(chǎn)生。如未達到預(yù)期效價，需再進行加強免疫，直到滿足時為止。
常用的佐劑是福氏佐劑（Freund adjuvant），其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2～9（V/V），這是不*福氏佐劑，在每毫升不*佐劑加入1～20mg卡介苗就成為*佐劑。每2～3周加強免疫一次。途徑的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈打針。因為不同個體對統(tǒng)一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱，因此經(jīng)常在打針抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保留備用。
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