分離純凈、完整的RNA對于分子克隆的實驗是很重要的，而且是進(jìn)行基因表達(dá)分析的基礎(chǔ)。在總RNA中，75-85%為rRNA（主要是28S－26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等組成。mRNA一般只占總RNA的1％左右，而且由于RNA酶（核糖核酸酶，RNase）廣泛存在、活性穩(wěn)定，其反應(yīng)也不需要輔助因子，因而在RNA的制備過程中只要存在少量的RNA酶就難以獲得完整的RNA；而所制備的RNA的純度和完整性又直接影響著RNA分析的結(jié)果，長度大于4kb的轉(zhuǎn)錄本本身存在的幾率更小，其對于痕量RNase的降解也比小轉(zhuǎn)錄本更敏感，所以RNA的制備與分析操作難度，克隆長片段的基因更加是一門藝術(shù)?？傊谒蠷NA實驗中，歸根結(jié)底就是防止RNA酶的污染，分離到全長的RNA。

在實驗中，一方面要zui大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。因為各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶，所以所有分離提取RNA的方案都是在能導(dǎo)致RNA酶變性或失活的化學(xué)環(huán)境中使RNA釋放出來。另一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學(xué)實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而為避免RNA酶的污染，實驗中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特別處理。

近年來，常用的RNA酶抑制劑主要有：（1）異硫氰酸胍。異硫氰酸胍是目前被認(rèn)為zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。（2）焦碳酸二乙酯（DEPC）。是一種強烈但不*的RNA酶抑制劑。DEPC通過和RNA酶的活性基團(tuán)的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性，使用濃度為0.05-0.1‰。（3）釩氧核糖核苷復(fù)合物。由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，因而能地抑制RNA酶的活性。其使用濃度為10 mmol/L。（4）RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑（RNasin）。是一種從大鼠肝或人胎盤中分離出來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶緊密結(jié)合形成復(fù)合物從而使其失活。（5）其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。本實驗采用DEPC對實驗中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等進(jìn)行處理。

總RNA制備的方法很多，如1）異硫氰酸胍－法，許多公司有現(xiàn)成的總rna提取試劑盒（如Trizol試劑盒，其實質(zhì)也是異硫氰酸胍－法），從而可快速有效地提取到高質(zhì)量的總RNA。2）超離心方法，可以獲得豐富且質(zhì)量高的RNA。缺點是實驗時間比較長，要求離心過夜。3）其它一些試劑盒，主要是利用某些特定的介質(zhì)吸附RNA，驅(qū)除其它雜質(zhì)以后，將純凈的RNA洗脫下來，這樣就可以在短時間內(nèi)獲得純凈的RNA。但是價格比較昂貴。

目前，zui常用的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。異硫氰酸胍－法的基本過程是：先將樣品（以動物的腺體或組織為例）放進(jìn)勻漿器中加入異硫氰酸胍變性液進(jìn)行勻漿裂解，再用酸性（水飽和酚）、抽提除去DNA和變性的蛋白質(zhì)，zui后用異丙醇沉淀出RNA。Trizol試劑法進(jìn)一步提高了RNA的提取能力，可以從多種組織和細(xì)胞中提取高質(zhì)量的非降解RNA。該法甚至可以從zui少100個細(xì)胞或1mg組織中提取RNA。本實驗就簡單介紹Gibcol公司的產(chǎn)品Trizol Reagent（Total RNA Isolation Reagent）的使用方法。不同公司的RNA提取試劑盒具體的使用方法略有不同，可參照產(chǎn)品使用說明書。

此外，不同組織中提取的RNA，其中殘留痕量RNase污染的幾率也不同，為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，對于貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩(wěn)定。為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃（用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物）。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當(dāng)準(zhǔn)備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍體積的乙醇，室溫放置3-5分鐘，10,000×g離心5分鐘。