PCR 反應(yīng)的zui大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。

1、污染原因

(1)標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(2)PCR 試劑的污染：主要是由于在PCR 試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR 核酸模板污染。

(3)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR 反應(yīng)中zui主要zui常見(jiàn)的污染問(wèn)題。因?yàn)镻CR 產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013 拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR 檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR 產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視，zui可能造成PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000 拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。

(4)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。

2、污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

對(duì)照試驗(yàn)：

(1)陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR 反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR 陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100 個(gè)拷貝以下)。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

(2)陰性對(duì)照：每次PCR 實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照：在PCR 試劑中不加模板DNA 或RNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

(3)重復(fù)性試驗(yàn)

(4)選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增

3、防止污染的方法

(1)合理分隔實(shí)驗(yàn)室：將樣品的處理、配制PCR 反應(yīng)液、PCR 循環(huán)擴(kuò)增及PCR 產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR 產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開(kāi)。能劃分①標(biāo)本處理區(qū)；②PCR 反應(yīng)液制備區(qū)；③PCR 循環(huán)擴(kuò)增區(qū)；④PCR 產(chǎn)物鑒定區(qū)。 其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍?xiě)?yīng)。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線(xiàn)消毒以破壞殘留的DNA 或RNA。

(2)吸樣槍?zhuān)何鼧訕屛廴臼且粋€(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(3)預(yù)混和分裝PCR 試劑：所有的PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR 產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(4)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

(5)設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的zui低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

(6)減少PCR 循環(huán)次數(shù)，只要PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

(7)選擇質(zhì)量好的Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開(kāi)離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

4、PCR 污染解決對(duì)策

PCR 檢測(cè)微量感染因子時(shí)，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問(wèn)題。

(1)污染的預(yù)防：進(jìn)行PCR 操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，zui大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。

(2)劃分操作區(qū)：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)*閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：

a、標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；

b、PCR 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR 擴(kuò)增；

c、產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。

各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分析，產(chǎn)物處理。

切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。

(3)分裝試劑：PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA 和其他來(lái)源的DNA：

a、PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；

b、引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；

c、引物和dNTP 應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。

(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：

a、戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；

b、使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

c、避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

d、操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的度；

e、zui后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；

f、操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；

g、盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA 的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該，不能交叉使用，尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；

h、重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。

5、追蹤污染源

如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。

(1)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100 個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR 敏感性*，可以從其它方法(Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等)檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。

(2)環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。

環(huán)境污染中常見(jiàn)的污染源主要有：

a、模板提取時(shí)真空抽干裝置；

b、凝膠電泳加樣器；

c、電泳裝置；

d、紫外分析儀；

e、切膠用刀或*片；

f、離心機(jī)；

g、冰箱門(mén)把手，冷凍架，門(mén)把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源。1)用無(wú)菌水浸泡過(guò)的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2)0。1ml 去離子水浸泡；3)取5ml 做PCR 實(shí)驗(yàn)；4)電泳檢測(cè)結(jié)果。

h、氣溶膠。如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物(與原引物無(wú)相關(guān)性)。

6、污染處理

(1)環(huán)境污染

a、稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA 脫嘌呤；

b、紫外照射(UV)法：紫外波長(zhǎng)(nm)一般選擇254/300nm，照射30min 即可。需要注意的是，選擇UV 作為消除殘留PCR 產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布，UV 照射僅對(duì)500bp 以上長(zhǎng)片段有效，對(duì)短片段效果不大。UV 照射時(shí)，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV 照射還可使二聚體斷裂。形成二聚體的程度取決于UV 波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類(lèi)型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長(zhǎng)DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0。065/堿基，其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶乙二醇，DNA 鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA 斷裂等)均可終止Taq DNA 聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。如果這些位點(diǎn)( 0。13/堿基)在DNA 分子上隨機(jī)分布，一個(gè)500bp片段的DNA 分子鏈上將有32 處損傷位點(diǎn)，那么，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果100bp 的片段，每條鏈上僅有6 處損傷，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒(méi)有任何損傷。這就是UV 照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。

(2)反應(yīng)液污染

可采用下列方法之一處理：

a、DNase I 法：PCR 混合液(未加模板和Taq 聚合酶)加入0。5U DNase I，室溫反應(yīng)30min 后加熱滅活，然后加入模板和Taq 聚合酶進(jìn)行正常PCR 擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA 的序列；

b、內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4 個(gè)堿基的內(nèi)切酶(如Msp I 和Taq I 等)，可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR；

c、紫外照射法：未加模板和Taq 聚合酶的PCR 混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV 照射法；

d、g 射線(xiàn)輻射法：1。5kGy 的輻射可*破壞0。1ng 基因組DNA，2。0 kGy 可破壞104 拷貝的質(zhì)粒分子，4。0 kGy 仍不影響PCR，但高于此限度會(huì)使PCR 擴(kuò)增效率下降。引物可受照射而不影響PCR，g 射線(xiàn)是通過(guò)水的離子化產(chǎn)生自由基來(lái)破壞DNA 的。

e、*糖苷酶(UNG)法：由于UV 照射的去污染作用對(duì)500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測(cè)的PCR 擴(kuò)增片段通常為300bp 左右，因此UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定。原理：在PCR 產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UDG 可裂解*堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG 對(duì)不含dU 的模板無(wú)任何影響。UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除*，而對(duì)RNA 中的*和單一*分子則無(wú)任何作用。

f、dUTP 法：用dUTP 代替dTTP，使產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR 擴(kuò)增前，用UNG 處理PCR 混合液即可消除PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG 在PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU 的新的PCR 產(chǎn)物。

g、dU 引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT，這樣PCR 產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU。UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對(duì)長(zhǎng)片段(1-2kb 以上)的擴(kuò)增用dUTP 法效率較用dTTP低，而用dU 法就可克服這一缺點(diǎn)。dU 引物將dU 設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來(lái)源的污染；UNG 處理可以和PCR 擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU 存在，可*消除污染源。需注意的是摻入dUTP 的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR 產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-(UNG 缺陷)大腸桿菌受體菌，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG 消化掉。

h、固相捕獲法：用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：1)用一*標(biāo)記的單鏈RNA 探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)；2)用包被鏈霉親和素的固相載體來(lái)捕獲帶有*探針的雜交核酸，通過(guò)漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3)洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA 探針雜交區(qū)域。第2)步的漂洗后可用PCR 檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。

i、RS-PCR 法(RNA-specific PCR)：也稱(chēng)為鏈特異性PCR，主要指用于RNA 模板的特異性PCR 法，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR 的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端(A 區(qū))有2 0 個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5ˊ端2 0 個(gè)核苷酸(C 區(qū))為附加修飾堿基。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使cDNA 與多余引物分開(kāi)，再用和第二引物(C)以*鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，以后的PCR 循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B 區(qū)和引物C 進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA，而污染的DNA 或質(zhì)粒DNA 才不會(huì)被擴(kuò)增。

j、抗污染引物法：該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過(guò)病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn)。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA 才能被引物擴(kuò)增，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽(yáng)性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。

附錄： 各種堿基符號(hào)

在設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物或測(cè)序時(shí)你可能會(huì)碰到這樣的符號(hào)來(lái)表示堿基，到時(shí)候不要不知道哦：

B = C or G or T

D = A or G or T

H = A or C or T

K = G or T

M = A or C

N = A or C or G or T

R = A or G

S = C or G

V = A or C or G

W = A or T

Y = C or T