pUC57 Simple TA/平端通用克隆載體

描述：pUC57 Simple 通用克隆載體采用了 TOPO 酶連接技術(shù)，載體預(yù)先偶聯(lián)上 TOPO 酶，當(dāng)加入 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后，5 min 就可以完成連接反應(yīng)，連接陽(yáng)性率高。pUC57 Simple 通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn) 品適用于 Taq 酶擴(kuò)增的含“A"尾巴和高保真酶擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物的連接，載體含有氨芐青霉抗性篩選標(biāo)記。 

注意：RTS DH5α 凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長(zhǎng)期保存（>2 年），已經(jīng)溶解后，請(qǐng)-60℃以下保存（3 個(gè)月）。
主要特征
（1）快速連接，僅需 5min；（2）操作簡(jiǎn)單，僅需加入載體和片段即可；（3）無(wú)需藍(lán)白斑篩選，陽(yáng)性率高；（4）不包含
任何酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)亞克隆（5）平末端和 A 尾產(chǎn)物通用。
注意：引物不能磷酸化。
測(cè)序引物
正向測(cè)序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；
反向測(cè)序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；
操作步驟
1. PCR 產(chǎn)物的純化
1.1 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測(cè)產(chǎn)物，如無(wú)非特異性擴(kuò)增、無(wú)引物二聚體、條帶單一明亮，則可采用 PCR 產(chǎn)物純化試劑
盒純化后用于連接。產(chǎn)物不經(jīng)純化也可以進(jìn)行連接，但效果稍差一些。
1.2 PCR 擴(kuò)增完畢后，電泳檢測(cè)產(chǎn)物，如有非特異性擴(kuò)增條帶或引物二聚體，則必須采用膠回收后用于連接。
1.3 PCR 擴(kuò)增模板來(lái)源于 Amp 抗性質(zhì)粒，則必須采用膠回收后用于連接。
2. PCR 用量和連接時(shí)間
PCR 產(chǎn)物大小 PCR 產(chǎn)物用量 載體用量 摩爾比 連接時(shí)間 陽(yáng)性率
0.1~1kb 2～10ng 1 μl 1: 5~10 5～10min >95%
1~3kb 10～20ng 1 μl 1: 5~10 15～20min >90%
>3kb 5ng/kb 1 μl 1: 5~10 30min >85%
3. 連接反應(yīng)
向 0.2 ml EP 管中依次加入如下試劑
成 分 用 量
PCR 產(chǎn)物 0.5~4 μl （用量參考上表）
pUC57 Simple Vector 1 μl
加無(wú)菌水至總體積為 5 μl
輕輕吹打混合均勻后，室溫（25°C）孵育 5～30min，通常放置 10min。
關(guān)于 PCR 產(chǎn)物的用量說(shuō)明：在 PCR 產(chǎn)物回收后（在無(wú)法進(jìn)行 NanoDrop 測(cè)定濃度的情況下），按照一般的經(jīng)驗(yàn)可估算產(chǎn)物
的用量，原則為：3 μl 回收產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰判斷的情況下，使用 0.5~1 μl 回收產(chǎn)物（約 5~15 ng）進(jìn)行連
接即可?；厥债a(chǎn)物難以觀察的情況下使用 4 μl 回收產(chǎn)物（約 5~10 ng）進(jìn)行連接。使用過(guò)高量的 PCR 產(chǎn)物將會(huì)導(dǎo)致連接效
率低下，長(zhǎng)斑數(shù)量和陽(yáng)性率急劇下降。

一、模板DNA：PCR反應(yīng)需要模板DNA，如從細(xì)胞、組織、血液中提取DNA等；

二、引物：PCR反應(yīng)的兩個(gè)引物，分別與模板DNA的兩端配對(duì)擴(kuò)增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過(guò)程中使用到的引物；

三、dNTPs：PCR反應(yīng)中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細(xì)胞分裂、DNA合成         等生物學(xué)過(guò)程，用于PCR擴(kuò)增的模板DNA鏈的延伸和擴(kuò)增；

四、Taq DNA聚合酶：PCR反應(yīng)需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴(kuò)增DNA鏈；

五、PCR buffer溶液：對(duì)PCR反應(yīng)具有緩沖作用，調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機(jī)化合物如甲醛，可增強(qiáng)PCR反應(yīng)特異性，從而提高反應(yīng)效率；

六、酶切體系：PCR擴(kuò)增往往涉及到重組、構(gòu)建和測(cè)序等等實(shí)驗(yàn)步驟，常常需要進(jìn)行酶切操作。

七、MARK:一種分子量標(biāo)準(zhǔn)，用來(lái)判別DNA片段大小的工具。

八、DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物；

①Oligo dT
選擇Oligo dT時(shí)，要求RNA必須有Poly A，所以真核生物的mRNA都適用。適合長(zhǎng)鏈甚至全長(zhǎng)mRNA的RT，對(duì)RNA樣品的質(zhì)量要求較高，不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進(jìn)行RT反應(yīng)，建議推薦使用Oligo dT引物。使用Oligo dT引物要比隨機(jī)引物和特異性引物的穩(wěn)定性要好。
②隨機(jī)引物
適合各種RNA的RT，尤其適合模板豐度很低的情況（比如某個(gè)gene表達(dá)量很低）。選擇隨機(jī)引物時(shí)，鏈cDNA合成反應(yīng)中就是以所有的RNA為模板，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增。同時(shí)要注意隨機(jī)引物的量和總RNA量之間的關(guān)系，一般建議每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量為50ng，如果每5µg總RNA的隨機(jī)引物的用量超過(guò)250ng，可能會(huì)導(dǎo)致小片段產(chǎn)物（＜500bp）的增加和長(zhǎng)片段、全長(zhǎng)產(chǎn)物的降低。
③特異性引物
基因特異性引物（GSP）是某個(gè)基因序列的一部分，與模板互補(bǔ)的引物。該引物需要結(jié)合目標(biāo)RNA的已知序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。由于引物和RNA序列特異性結(jié)合，每個(gè)目標(biāo)RNA都需要一套新的基因特異性引物。因此，當(dāng)分析多種目標(biāo)時(shí)，則需要適用更多的RNA樣本。而且不同引物退火溫度本來(lái)就不相同，所以一般不推薦使用。如需要使用特異性引物，建議對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。